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[Dyne 22nd 기초실험방] 크로마토그래피 ( Chromatography)-II

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작성자 다인바이오 작성일14-05-30 12:49 조회29,145회 댓글0건

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크로마토그래피 ( Chromatography)-II 

 

 

1.     크로마토그래피의 종류

크로마토그래피는 고정상과 이동상, 혹은 고정상의 특성 등에 다양한 종류가 존재한다. 각 크로마토그래피는 특성이 상이하기 때문에 혼합물의 특성이나 효율성에 따라 알맞은 방법을 선택할 필요가 있다.

 

(1) 고정상의 특성 (정지상의 형태)에 따른 분류

 

1) 면 크로마토그래피 (planar chromatography)


2) 관 크로마토그래피 (column chromatography)

특정한 정지상을 긴 원통column에 채우고 이 통 안으로 이동상을 밀어 넣는 방식을 취한다. 대부분의 크로마토그래피 장치가 이것으로 유기 합성을 주로 하는 실험실에서는 가끔 높이가 1m가 훨씬 넘는 크고 아름다운 컬럼도 볼 수 있다. 한 번 할 때마다 평균 5% 내외의 손실이 발생하며, 숙련된 사람은 더 줄일 수도 있다.


3) 종이 크로마토그래피 (paper chromatography)

종이 크로마토그래피만 그 원리가 약간 다르다. 분리하려고 하는 혼합물의 반점을 종이조각의 끝 부분에 만들고 이 종이 끝을 용매 속에 잠기게 (반점은 잠기지 않게)하면 용매가 종이를 따라 스며 올라가면서 혼합물이 분리되어 각각의 반점을 형성한다. 종이 크로마토그래피에서는 종이의 섬유질에 세게 흡착되어 있는 극성인 액체상 (보통은 물)과 용출용매 사이에 서로가 분포된다. 따라서 이것은 액체-액체분배 크로마토그래피이다.

 

(2) 이동상과의 상호작용/정지상과의 상호작용 형태에 따른 분류

기본적으로 고정상과 이동상은 친수성/소수성을 각각 쓰거나 (정상 크로마토그래피), 소수성/친수성을 각각 쓴다 (역상 크로마토그래피). 이외에도 분자를 분리하는 방법에 따라서 다음과 같은 기술이 있다.

 

 1) 분배 크로마토그래피 (partition chromatography)

2개의 서로 섞이지 않는 액체를 각각 이동상과 고정상으로 하여 이 양자에 대하는 시료 성분의 친화성의 차, 즉 분배계수의 차이를 이용하여 성분 분리를 하는 크로마토그래피를 말한다. 액체-액체간에서의 용질의 분배현상에 기초하여 분리가 달성되므로 액체-액체 크로마토그래피라고도 한다. 이전에는 고정상이 되는 액체를 적당한 담체에 스며들게 한 것을 고정상으로 하고 이 고정상 액체를 미리 포화한 용매를 이동상으로 사용하였다. 그러나, 최근에는 고정상 액체에 상당하는 물질을 화학결합에 의해 담체에 강력히 결합시킨 것으로 이동상의 종류, 혼합용매의 조성, 칼럼 온도 등은 이전과는 비교가 되지 않을 정도로 자유롭게 변경하여 사용할 수 가 있어 다종 다양한 식품시료의 분석에 이용이 가능하다. 특히 역상계의 분배 크로마토그래피는 그 응용범위가 대단히 넓고 식품 성분분석에 있어서도 널리 응용되고 있다.

 

 2) 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)

정지상에 특정 물질과 매우 잘 붙는 무엇인가를 붙여서 내가 원하는 물질만 딱 집어서 빼내는 기법이다. 상호작용의 비율 차가 매우 극심하다고 보면 된다. 친화성 크로마토그래피는 용질분자와 지지체 위에 결합되어 있는 리간드 사이의 특이한 화학적 상호작용에 기초한다 (그림 1).

 

 

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그림 1. 친화성 크로마토그래피

 

 

리간드와 용질 사이의 친화성 결합은 분자의 크기와 모양에 특이할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에서는 용질 중 한 성분이 정지상의 리간드와 특이한 상호작용으로 결합함으로써 다른 용질들과 분리된다. 따라서 컬럼 내 정지상에 단지 한 용질과만 고유하게 상호 작용하는 리간드를 공유결합으로 붙인다. 시료를 이 컬럼에 통과시키면 단지 한 용질만 정지상에 붙게 된다. 그 다음 다른 성분들을 잘 씻어 버린 후, 달라붙은 성분은 용질과 정지상 간의 결합을 약화시킬 수 있는 조건으로 바꿔 줌으로써 용리된다. 예를 들면, 공유 결합된 리간드가 특정한 단백질에 대해 항체인 경우이다. 여러 종류의 단백질을 포함한 혼합물이 컬럼을 통과할 때, 단지 항체와 반응하는 하나의 단백질만 컬럼에 결합된다. 다른 모든 단백질이 컬럼을 통해 씻겨 나간 후, pH를 변화시키거나 이온세기를 변화시킴으로써 결합되어 있는 특정한 단백질을 항체로부터 떨어지게 하여 회수한다.

이러한 방법은 효소, 항원, 특이적 핵산, 비타민 결합 단백질, , 호르몬 수용체 같은 물질을 순수 분리할 때 자주 이용된다.

 

크로마토그래피를 위한 지지체 선택시 고려사항은 낮은 비특이적 친화성, 높은 투과성 및 pH, 계면활성제에 대한 안정성, 활성 기능기 (functional group)의 이용성, 높은 효율의 다공성 (porosity) 등이다. 이러한 사항을 충족시켜주는 지지체에는 아가로오스 담체 (beads), 폴리아크릴아마이드 담체, 조절된 다공성 (controlled porosity) 유리 담체 등이 있다. 아가로오스 담체는 가장 많이 쓰인다. 그러나 용리시킬 때 변성제 (denaturant)가 응축되기 쉽다는 단점이 있다. 폴리아크릴아마이드 담체는 여러 조건을 충족시키기는 하지만 다공성이 부족하다.

조절된 다공성 유리 담체는 물리 화학적으로 안정해서 다양한 조건에서 전개 속도가 좋다. 그렇지만 비특이적 단백질 흡착이 많으며 작용기가 적다는 단점이 있다. 이 문제는 유리 표면에 덱스트란이나 다른 물질로 표면 처리 함으로써 극복할 수는 있다.

친화성 크로마토그래피에서 리간드를 붙일 때 고체 지지체 (matrix)에서 되도록 긴 리간드를 붙이는 것이 좋다. 만약 리간드가 지지체에 바로 결합되어 있다면 거대 분자는 입체 장애 (steric hindrance) 때문에 리간드에 접근할 수 없다. 그래서 종종 지지체와 리간드 사이에 팔 (arm)을 붙인다.

친화성 크로마토그래피에서 리간드와 단백질 사이의 친화성이 너무 높거나 낮으면 좋지 않다. 기질이 리간드로 쓰일 경우에는 효소가 촉매 역할을 하지 않도록 촉매작용에 필요한 금속 이온을 제거하거나, KmKcat또는 pH가 다른 경우 온도를 낮추거나 pH를 변화시킨다.

리간드에 결합된 단백질을 분리하는 방법에는 두 가지가 있다. 첫 번째는 지지체에 리간드보다 친화성이 더 큰 물질을 포함하는 용리액으로 분리해 내는 방법이다. 다음으로 pH를 변화시키거나 온도, 이온세기 등을 변화시키는 방법이다.

 

3) 분자 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography, SEC)

미세한 체와 같은 작은 구슬들을 가득 채운 컬럼을 쓴다. 이때 재미있는 것이, 상대적으로 큰 물질은 저 구슬 속으로 들어갈 수 없기 때문에 이동 거리가 짧아져서 빨리 나오게 되고 상대적으로 작은 물질은 구슬 속을 들락날락할 수 있어 이동거리가 길어지므로 늦게 나오게 된다. 구슬의 크기나 특성에 따라서 걸러낼 수 있는 크기가 정해지게 된다.

 4) 역상 크로마토그래피 (reverse-phase chromatography)

물질의 극성 차이에 따라 상호작용의 차이가 날 수 있도록 한다. 이름이 왜 저렇게 붙었나 하면, 일반적으로 사용되던 정지상이 보통 실리카 또는 알루미나와 같은 극성물질이었는데 이 기술에 사용된 정지상은 비극성 물질이었기 때문에 크로마토그램이 나오는 순서가 예전 것과는 거꾸로였기 때문이다. Normal-phase는 이 역상의 반대, 즉 극성 정지상을 쓰는 경우에 해당하지만 원리는 같다.

5) 이온 교환 크로마토그래피 (ion exchange chromatography)

정지상을 이온화시켜서 물질의 이온화 정도에 따라 상호 작용 차이가 나게 만든다. 생화학이나 분자생물학에서 단백질을 정제할 때 친화도 크로마토그래피와 더불어 매우 자주 보게 된다. 서로 다른 단백질은 특정 pH에서 서로 다른 전하를 가지게 되기 때문이다.

6) 흡착 크로마토그래피 (absorption chromatography)

흡착제를 고정상으로 쓰는 크로마토그래피. 즉 흡착제에 대한 시료성분의 흡착과 탈착의 난이도의 차이에 의해 여러 성분끼리의 분리가 이루어지기 때문에 이와 같이 불린다. 또한 이동상의 상태에 따라 기·고크로마토그래피 또는 액·고 크로마토그래피라고도 불린다. 흡착액체 크로마토그래피에서 유기용매에 가용인 비이온성 성분의 분리, 특히 극성이 다른 치환기를 갖는 성분끼리의 분리 등에 유용하지만, 유사한 구조를 갖는 동족체 등의 분리에는 그리 적합하지 않다. 또한 시료성분은 흡착제의 활성부위에 흡착되지만 그때에 화학적으로 대단히 불안정한 성분은 화학변화를 받거나 손실될 우려가 있다. 흡착제로는 silica gel, alumina, 다공성중합체 등이 있지만, 화학적인 활성이 거의 없고 칼럼 효율 등이 좋은 silica gel이 널리 사용되고 있다. 일반적으로 흡착제의 표면적이 클수록 시료성분은 강하게 유지된다. 또한 그 유지력은 흡착제의 함수율에 의해 크게 좌우된다. 경우에 따라 분리효율의 저하나 불가역적인 흡착이 나타나는 경우도 있다. 따라서 재현성이 있는 분리를 하기 위해서는 고정상의 함수율을 일정하게 유지하도록 주의해야 한다.

 

(3) 이동상의 특성에 따른 분류

   1) 기체 크로마토그래피 (gas chromatography)

가스화된 이동상에 혼합물을 섞어 넣은 다음, 이를 컬럼에 통과시켜서 부분균형 partial equlibrium에 따른 분리를 한다. 범죄수사에 사용되는 장비가 대개 이것이고, 환경감시나 독가스 등의 검출에서도 사용되고 있다. 특히 전쟁중 화학전이 일어날 경우 가스 검출에 매우 중요한 기술이 된다.

 

  2) 액체 크로마토그래피 (liquid chromatography)

액체 이동상에 혼합물을 섞어서 쓰는 장비. 이 장비가 고성능화되면 HPLC (High Performance Liquid Chromatography), 그 이상일 경우 UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)라고 부른다. 보통 볼 수 있는 크로마토그래피 장비(=정수기)가 대개 이것에 속한다. 실험실에서 쓰는 액체 크로마토그래피는 거의 대부분이 자동화되어 있어 컴퓨터로 모든 과정을 편하게 컨트롤할 수 있다.

 

  3) 초임계 크로마토그래피 (supercritical fluied chromatography, SFC)

물질의 정확한 정량과 정성을 위해 적용되는 분리기술은 액체크로마토그래피 (LC)와 가스크로마토그래피 (GC)의 두 큰 범주가 대부분이며, 거의 모든 과학자들 또한 이 두 기술을 이용한 물질의 분리에 익숙해져 있는 것이 사실이다. 그러나, 두 기술에서의 약점들, 독성 용매의 사용으로 인한 실험실내 환경 문제, 에너지 소모량 증가, 직교성 정보 한계, 보다 나은 분리 분석 결과 확보, 생산성 등을 보완할 수 있는 분리 기술인 초임계유체크로마토그래피 (SFC; Supercritical Fluid Chromatography)의 분명한 장점이 있음에도 불구하고, 이제까지 여러 가지 기술적 한계로 인하여 기술 도입이 더디게 이루어지고 있다.

초임계상태의 CO2는 친환경적이며, 무독성, 고압 상태로의 용기 저장이 손쉬우며, 또한 값싼 용매이다. 점성이 낮아 운용압력의 감소가 가능하며, 같은 입자 크기와 선속도 조건에서 분리 효율 향상을 가져올 수 있다. 또한, CO2는 적은 에너지로 임계점에 도달할 수 있는 최상의 물질이다. 그에 반해, 전형적인 순상 (이하 NPLC) 및 역상 (이하RPLC) 이동상의 경우 상대적으로 높은 점성과 독성, 그리고 압축 저장이 불가능한 유기 용매를 사용한다. 더욱이 HPLC 급 용매, 특히 RPLC 분석용 용매, 물을 포함한 HPLC 용 용매는 매우 비싸다. 초임계유체 크로마토그래피는 이동상으로 주로 CO2를 사용하며, 적은 비율의 메탄올 또는 다른 유기용매를 보조 이동상으로 사용하는 방식으로, NPLC의 구성 및 분석 방식과 유사하며, 특히, prep 스케일의 키랄 (Chiral) 화합물의 분리 및 분취에 주로 이용된다. 그러나, HPLC 또는 UPLC에서와 같은 정교하고 발전된 용매 이송 장비와 달리, 초임계 상태의 CO2를 재현성 있고 신뢰할만한 수준으로 운송할 수 있는 장치가 없었으며, 온도, 압력, 밀도 등과 같은 중요한 변수들을 컨트롤 할 수 없었기에 SFC 시스템을 분석용 성능으로 운용하는 데 한계가 있었다. 그러한 결과로, SFC는 분리 과학에 있어 특정한 경우에만 사용되고 있는 실정이다.

초임계유체 크로마토그래피는 액체 크로마토그래피나 기체 크로마토그래피의 단점을 보완한 장치이다. 초임계유체는 주어진 온도에서 용매력이 밀도에 의존(온도와 압력에 의존)하므로 용리는 압력 프로그래밍의 형태로 행해진다. 대부분의 경우 온도는 고정되고 시간에 따라 압력이 증가하도록 프로그램된다. 압력을 변화시킴으로써 용매의 밀도와 용해도, 용질의 체류시간을 변화시킬 수 있다. 초임계유체 크로마토그래피는 낮은 점도를 가지므로 컬럼을 통과하는 동안 발생한 압력강하를 줄일 수 있다. 액체 크로마토그래피는 기체 크로마토그래피나 초임계유체 크로마토그래피에 비해 100배 정도의 점도를 갖는데 이로 인해 액체 크로마토그래피는 기체 크로마토그래피나 초임계유체 크로마토그래피에 비해 10에서 100배에 이르는 압력강하를 갖는다. 초임계유체 크로마토그래피를 사용하므로써 컬럼의 길이를 늘일 수 있다. 온도도 단독으로 프로그래밍되거나 압력 및 밀도 프로그래밍과 함께 프로그래밍될 수 있어서 휘발성이 낮거나 높은 물질을 분리할 때 유용하다. 온도 프로그래밍을 사용할 때는 주의할 점이 있는데, 밀도나 압력이 용질의 체류시간에 직접 관련되는 데 비하여 온도 프로그래밍이 용질 선택도에는 영향을 주지만 각각의 용질의 체류시간을 예측하기 어렵게 만든다는 것이다. 초임계유체 크로마토그래피에서는 기울기 용리(gradient elution) 또한 가능한데, UV검출기가 장착된 충진컬럼에서 사용된다. 이산화탄소가 이동상으로 사용되는 경우 충진컬럼보다 모세관컬럼을 사용할 때 유기용매의 체류시간에 대한 영향이 적다. 유기용매를 첨가하는 것은 FID를 사용하는 것을 크게 제약하여 액체 크로마토그래피를 사용할 때의 단점을 극복한 초임계유체 크로마토그래피의 잇점을 없앤다. 그러므로 용매 프로그래밍은 모세관컬럼에 대해 거의 사용되지 않는다.

 

2.     흡착 크로마토그래피 (adsorption chromatography)

가장 오래된 chromatography type으로 고정상으로 사용되는 고체 흡착제의 표면과 이동상으로 사용되는 액체에 대한 친화력의 차이에 의해 물질을 분리하는 방법이다.

GSC의 경우, 이동상은 비활성 기체를 이용하므로 고정상에 대한 시료의 친화력 차이로만 분리된다.

Paper chromatography의 경우, cellulose 격자 사이에 붙잡혀 있는 water에 분배되는 원리를 이용하므로 분배 크로마토그래피에 해당된다.

    용질-용매간 작용하는 힘 (intermolecular forces)

Van der Waals

Electrostatic

Hydrogen bonding (polar, 가장 중요)

Hydrophobic interaction (nonpolar)

    고정상으로 사용되는 흡착제의 종류

Silica (SiO2, slightly acidic and polar)

Alumina (Al2O3, slightly basic and polar)

Magnesium oxide

Charcoal (nonpolar)

Starch

 

3.     분배 크로마토그래피 (partition chromatography)

가장 일반적인 chromatography type으로 고정상으로 사용되는 고체 지지체의 표면 액상과 이동상으로 사용되는 액체에 대한 분배력의 차이가 물질의 분리를 좌우한다.

고정상은 다공성 지지체에 화학적으로 결합되어 있다.

    Normal phase

- 고정상은 이동상보다 more polar

- 비극성 화합물이 먼저 용출된다.

    Reverse phase

- 비극성 고정상과 극성 이동상 사이의 분배 정도 차이를 이용한 방법

- 극성 화합물이 먼저 용출된다.

- 일반적으로 많이 사용되며 이동상으로 사용되는 용매들은 다음과 같다.

Water/Metanol/Acetonitrile/Isopropanol/Dioxane/Tetrahydrofuran/Mixed Solvents (from above)

 

 

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그림 2. 분배 크로마토그래피 (partition chromatography)의 원리

 

 

1)    이온교환 크로마토그래피 (Ion-exchange chromatography)

이온성 화합물 및 무기이온의 분리에 사용되며, electrostatic force를 이용하여 물질을 분리한다. Polystyrene or silica gel 표면에 이온성을 가진 화합물을 화학적으로 결합한 고정상 사용하며, 이동상으로는 완충액을 사용한다. 시료의 분리의 pH, 이온 세기, 이동상에 포함된 이온 종류의 영향을 받는다.

 

2)    크기배제 (Size exclusion chromatography)

일정한 크기의 공극을 형성시킨 다공성 polystyene이나 silica gel를 충진입자로 사용하며, 공극의 크기에 따라 분리되는 시료의 분자량대가 다르다. 시료의 물질적 특성 (크기)에 따른 분리 방법이다.

이동상은 고정상에 대해 비활성이며, 수용성 용매일 경우 GFC (Gel filtration chromatography), 지용성 용매일 경우 GPC (Gel permeation chromatography). 분자량이 큰 분자가 먼저 빠져 나오고, 분자량이 작은 분자는 나중에 빠져 나오게 된다.

 

 

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그림 3. 크기배제 크로마토그래피 (Size exclusion chromatography)

 

 

 

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