Dyne 제품 FAQ - Dyne Plasmid Mini Prep Kit (A510)

Q: Plasmid DNA 회수율이 낮은 것 같아요.

è  균주가 fresh한지 확인해봅니다.
   : 다른 bacteria 균주를 사용해 봅니다. 
è  Bacteria lysis 과정이 완전하게 되었는지 확인해봅니다. 
   : Protocol 보다 많은 양의 bacteria 사용 한 경우는 bacteria 양을 반으
    로 줄여 봅니다.
   : Buffer Sol II의 NaOH가 외부의 CO₂에 빈번하게 노출되면 Buffer의 효
    능이 떨어질 수 있습니다.  
è  Cell resuspension과정이 완전하게 되었는지 확인해봅니다.
   : Buffer Sol I 첨가 후 강력하게 vortex를 하여 bacteria pellet을 완벽하
    게 resuspension 합니다.
è  65℃에서 pre-warming elution buffer를 column에 분주하고 5min간 상온에 방치 한 후 centrifuge를 실행합니다.  <?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" />

Low DNA quality
è   순수한 Plasmid DNA의 OD값은 1.7이상 ~ 1.9이하입니다.  OD값이 1.7미만인 경우  Protein 혼합되어있고, OD값이 1.9초과한 경우는 RNA 혼합되어있습니다.  

Q: OD값이 낮아요. ( 1.7미만)

è  Agarose gel에서 일어나는 현상으로 gel상에 high background 현상이 나타납니다..
è  많은 양의 bacteria 사용 유무를 확인합니다.
è  resuspension이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer)
è  lysis 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol II)
è  Neutralization 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol III)

Q: OD값이 높아요. (1.9초과)

è  Agarose gel에서 일어나는 현상으로 gel상에서 RNA smear or band가 나타납니다.
è  Buffer Sol I에 RNase A를 첨가했는지 확인합니다.
è  Buffer Sol I 이 오래된 것인지 또는 RNase A 활성도가 떨어 졌는지 확인합니다.
è  많은 양의 bacteria 사용 유무를 확인합니다.
è  resuspension이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer)
è  lysis 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol II)

Q: 아가로즈 젤에서 Plasmid 가 smear현상이 나타났어요.

è  endA+ bacteria균주를 사용했는지 확인합니다. ( endA+: endonuclease로 plasmid 자체를 자릅니다.)
è  Bacteria culture를 너무 오래 하지 않았는지 확인합니다.
è  Harvest한 bacteria를 너무 오래 또는 높은 온도에서 보관하지 않았는지 확인합니다.
è  lysis 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol II)
è  Neutralization 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol III)

Q: 아가로즈 젤에서 목적 band 위에 희미하게 1 or 2개의 밴드가 나타났어요.

è  Supercoil band 가 가장 선명하며, 그 위에 약하게 nick, dimeric form의 밴드가 나타나는데  이런 현상은 매우 빈번하게 일어나는 현상으로 실험에 큰 영향을 미치지 않습니다.    

Q: 아가로즈 젤 상에 High background가 나타났어요.

è  Bacteria debris나 bacteria genomic DNA/ RNA가 혼합되어 있는 경우가 많습니다.
è  Bacteria culture를 너무 오래 하지 않았는지 확인합니다. ( cell death, lysis)
è  Harvest한 bacteria를 너무 오래 보관하지 않았는지 확인합니다.
è  lysis 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol II)
è  Neutralization 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol III)

Q: Genomic DNA 혼합되어 있어요

è  Bacteria culture를 너무 오래 하지 않았는지 확인합니다. ( cell death, lysis)
è  많은 양의 bacteria를 사용했는지 확인합니다.
è  Buffer Sol II를 첨가하고 과도하게 흔들어 주었는지 확인합니다.
è  lysis 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol II)
è  Neutralization 과정이 잘 되었는지 확인합니다. (Buffer Sol III)
è  Buffer SolII를 넣고 다음 단계인 buffer SolIII 첨가하기 전까지 오랜 시간 방치 했는지를 확인합니다. (Protocol에서는 SolII를 첨가하고 5분 이내 SolIII 단계로 넘어 가야 합니다.)

Q: RNA가 혼합되어 있어요

è  일반적으로 약간의 RNA가 남아 있어도 다음 실험에서는 크게 문제 되지 않습니다.
è  Buffer SolI에 RNase A 첨가했는지 확인합니다. 또한 보관온도를 확인합니다. (4℃)
è  Buffer SolI, Buffer SolII 과정이 잘 되었는지 확인합니다.  

Q: Plasmid DNA elution후 제한효소 나 기타 enzyme 반응이 일어나지 않아요

è  일반적으로 salt or ethanol이 혼합되어 있는 경우 이런 현상이 발생 할 수 있습니다.
è  가끔 plasmid 자체적으로 몇 세대가 지나면서 deletion 되는 경우가 발생합니다.

< plasmid mini prep kit tip>

1.     Column의 보관은 어떻게 할까요?
è  모든 실험의 시작은 재료의 준비에서부터 시작됩니다. 당사의 제품은 보증기간이 1년으로 되어 있습니다. 그러나 user분들의 보관 상태에 따라서 yield나 purity에 차이가 발생할 수 있습니다. 혹시 column이 아무렇게나 open된 상태로 방치되어 있지는 않나요? 밀봉된 상태로 습기가 없는 곳에서 보관해주세요.

2.     실험에서는 단계별 step을 정확히 밟아가는 것이 yield나 purity면
에서 중요합니다. cell 내에 존재하는 DNA를 추출하기 위해서는 충분한 suspension이 중요합니다. 또한 tapping으로 pellet이 완전히 풀어졌는지 확인해주십시오. 완전히 풀리지 않았다면 resuspension을 해주세요.

3.     Sol I부터 III까지 처리한 후에 원심분리를 진행하는데 원심분리의 시간이나 rpm을 10분, >13000rpm으로 정형화하고 있으나 원심 분리 후 상층액이 맑고 깨끗하지 않은 경험이 있다면 원심분리 시간이나 rpm을 좀 더 늘려보시는 것을 권해드립니다

4.     상층액을 column으로 옮길 때에는 하얀 불순물이 딸려 들어가지 않도록 주의하는 것이 중요합니다