[Dyne 6th 기초 실험방] 내열성 DNA polymerase

내열성 DNA polymerase 

- DNA 의존성 DNA 중합효소 (EC 2.7.7.7.)

- 4종의 디옥시리보뉴클레오시드-5'-3'인산에서 피로인산을 유리하고, DNA를 중합하는 반응을 촉매하는 효소. 주형으로 DNA를 필요로 하고, 합성된 DNA는 주형에 상보적인 염기 배열을 갖는다. DNA의 복제, 회복에 관여하는 중요한 효소로, 여러 세포로부터 분리된다. (출처: 아카데미생명과학사전 2003판)

- DNA 중합을 촉진하는 효소. 주형 (template) DNA의 염기 배열 순서에 맞추어서 이에 서로 상보적인 염기를 지닌 디옥시리보뉴클레오타이드 (deoxyribonucleotide, dNTP)를 인산이중 에스터(phosphodiester) 결합으로 연결함으로써 새로운 DNA 사슬을 5’에서 3’ 방향으로 합성한다. DNA의 복제와 회복에 관여하는 중요한 효소 (출처:한국생물공학회)

 

1. DNA Polymerase의 분류

DNA polymerase는 그 기능상 모든 생물이 가지고 있다고 생각된다. 분자생물학이 발전하기 이전에는, DNA polymerase를 기질특이성과 저해제에 대한 감수성 등으로 분류하였지만 유전자가 클로닝되어 아미노산서열이 추정되면서 구조적으로 분류되기 시작하였다. 이에 따라 크게 구분하여 대장균 DNA polymerase I으로 대표되는 Pol I family, 그리고 사람 DNA polymerase α로 대표되는 α-family로 분류되어 왔다. 최근에는 50종류 이상의 DNA polymerase들의 유전자구조가 밝혀져 family A, B, C, X의 4종류로 분류하는 것이 제창되고 있다. 그중 위의 두가지 family는 각각 A와 B에 속하고, C는 대장균 DNA polymerase III로, X는 사람 DNA polymerase β와 Terminal transferase로 대표된다. 같은 family에 속하는 것은 공통의 아미노산 서열을 가지고 있고 효소의 생화학적 성질, 예를 들면 DNA 합성속도, process에 의해 효소가 기질 DNA에 결합해서 분리될 때까지 합성되는 nucleotide의 수, 주형-primer 종류에 대한 선호성이나 저해제에 대한 감수성에 있어서 유사하다.

대장균에서는 3종류의 효소가 순화, 동정되어 있다.

(1) DNA중합효소Ⅰ(pol Ⅰ로 약기)

(2) DNA중합효소Ⅱ: 분자량 12만. 3‘→5‘의 핵산말단가수분해효소 활성만을 갖는다.

(3) DNA중합효소Ⅲ: 분자량 13만. 5‘→3‘과 3‘→5‘의 핵산말단가수분해효소 활성을 갖는다.

 

	DNA중합효소Ⅰ	DNA중합효소Ⅱ	DNA중합효소Ⅲ
분자량	110,000	120,000	＞130,000
효소작용	5′→3′ 방향으로 합성 DNA의 양쪽 끝부터 분해하는 핵산말단가수분해효소작용	5′→3′ 방향으로 합성 3′→ 5′ 방향으로 분해하는 핵산말단가수분해효소작용	5′→3′ 방향으로 합성 DNA의 양쪽 끝부터 분해하는 핵산말단가수분해효소작용
지배유전자	polA	polB	polC(dnaE )

 

DNA중합효소Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ은 모두 완전한 2중가닥 사슬구조 그대로 DNA를 주형으로 하여 DNA합성을 할 수 없다.

 

2. 생화학적 성질

 

(1) 내열성

DNA polymerase의 내열성은 그 효소를 생산하는 호열성 세균의 생육온도와 연관성이 있다. Taq polymerase의 내열성은 연속적으로 92.5℃에 놓아두면 160분 후에도 80% 이상의 활성을 가지고 있다. 96℃에서는 35분에 활성이 반감하지만, 96℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분의 사이클로 반복하면 40 cycles에서 반감한다. 이것은 PCR반응에는 열안정성이다 (Takara).

 

(2) DNA가닥 신장능력

Pol I형의 효소는 시험관 내에서의 DNA 신장활성이 강하다. 예를 들면 M13 phage의 한가닥 DNA에 primer를 하나 annealing하고 DNA polymerase를 첨가한 뒤 합성능력을 보았는데, Pol I형인 Taq polymerase (TaKaRa) 및 BcaBEST polymerase (TaKaRa)와 α형 효소인 Pfu polymerase (Stratagene) 등을 활성화 DNA를 주형-primer로 하여 얻은 활성으로부터 동일한 활성단위 (0.6U)를 사용하여 primer 신장을 시작한 후 시간경과에 따른 신장능력을 비교한 결과, BcaBEST, Taq에 비해 Pfu polymerase의 신장능력은 낮았다. 약 8kb의 M13 DNA를 일주하는데 BcaBEST, Taq은 5분 이내인데 반하여 Pfu는 20분 정도 소요된다. 이것은 PCR반응에 있어서는 불리한 성질이다.

 

(3) 정확도 (fidelity)

DNA polymerase의 DNA 합성에 있어서 정확도는 돌연변이 출현빈도로 나타낸다. 예를 들면 Taq polymerase에서 보고되고 있는 1~2X10^-4수치³⁾는 1회의 DNA가닥 합성시 10,000 necleotide에 1~2개의 비율로 주형 DNA와 mismatch를 일으키는 변이가 생기는 것을 의미한다. 돌연변이 빈도측정으로 각 DNA polymerase의 정확도를 비교할 수 있지만, 이 값은 측정조건에 크게 영향을 받는다. 즉, dNTP 농도, 주형-primer의 종류, 반응온도, 염과 금속이온의 종류, 변이 검출의 방법 등이 다르면 결과도 달라진다. 따라서 DNA polymerase의 정확도를 비교할 때는 동시에 같은 조건으로 변이빈도를 측정해야 한다.

 

(4) Termination extension 활성

DNA polymerase를 사용한 시험관내 DNA 합성의 경우, 여러 DNA polymerase에 의한 합성가닥은 주형 DNA의 3’ 말단에서 정확하게 멈추지 않고 1개의 nucleotide가 여분으로 부가된다. DNA polymerase가 가지고 있는 terminal transferase 활성을 말단기 부가 활성이라 부르지만 그 강도는 DNA polymerase의 종류에 따라 다르고, 같은 DNA polymerase라도 주형 DNA 말단의 서열에 따라 다르다. 이 성질은 PCR에 의한 증폭 DNA 단편을 plasmid vector에 삽입하고 싶은 경우에 중요한 문제가 된다. 말단기 부가 활성에 의한 3’ 말단에서의 1 nucleotide 부가는 전가닥에서 일어나는 것이 아니기 때문에, PCR 산물의 말단은 평활말단과 1 nucleotide가 돌출한 것이 섞여 있어, 사용하는 DNA polymerase의 종류나 primer의 서열 등에 따라 그 혼합비도 다르다. 따라서, PCR 산물을 평활말단화한 벡터에 연결하는 것만으로 목적의 형질전환체를 얻을 수 있는 확률은 극히 낮다. 3’ 말단에 부가하는 nucleotide는 거의 deoxyadenosine이므로 T 벡터라 불리는 dideoxythymidine이 하나 3’ 말단에 돌출한 open circular 백터가 개발되어 시판되고 있다. 3’→5’ exonuclease 활성이 강한 DNA polymerase는 평활말단을 가지고 있는 산물을 생성하여 cloning 과정에서 상기의 내용을 고려하지 않아도 된다는 보고가 있다.

 

(5) 역전사 활성

대장균의 Pol Ⅰ에 역전사활성이 있는 것은 오래전부터 알려져 왔지만, PCR의 출현 후 Taq polymerase의 역전사 활성을 이용하여 mRNA로부터 한번에 PCR까지 수행하는 방법이 보고되었다. 그러나 증폭에는 다량 (1~5 ㎍)의 RNA가 필요하거나 소량의 RNA로는 검출에 southern hybridization법이 필요하였기 때문에 실용적이지 않았으나, 그 후 Tth polymerase 등 보다 강한 역전사활성이 있는 효소가 발견되어 single tube RT-PCR(역전사 PCR)이 실용화되었다. Tth polymerase의 역전사활성은 금속이온 Mn²⁺가 존재하면 보다 강해지기 때문에 MnCl₂존재하에서 역전사반응을 실시하고, EGTA로 킬레이트한 후 MgCl₂를 첨가해 PCR을 실시하는 방법이 이용되고 있다.

 

(6) 기질 아날로그의 선택성

PCR의 응용범위가 넓어짐에 따라 목적에 따라 그에 맞는 다른 능력을 갖는 DNA polymerase가 요구된다. 예를 들면 반응액의 오염을 방지할 목적으로 dTTP를 대신하여 dUTP를 이용한 PCR을 실시한 후, uracil-N-glycosidase를 처리해 혼입 DNA를 분해하는 경우, oligonucleotide를 이용한 부위특이적 변이도입법을 위해서 주형 DNA에 dUTP를 삽입하는 경우, 그리고 증폭절단을 hybridization의 probe로서 이용하기 위해 형광물질과 biotin을 부가한 dUTP 유도체를 기질로 사용하는 경우 등이다. 더욱이 GC가 풍부한 영역을 증폭하고 싶은 경우에는 dGTP 대신 d7cGTP (7-DEAZA-guanosine triphosphate)을 이용하면 성공하는 경우가 있다. 이처럼 천연의 A, G, T, C 이외의 염기를 가진 nucleotide를 삽입한 DNA 가닥을 합성하는 경우, Taq polymerase를 이용하는 것이 좋다. Vent polymerase와 Pfu polymerase에서는 이와 같은 DNA 가닥의 합성은 잘 되지 않는다. 기질로서의 nucleotide만이 아닌 primer 서열 중에 G대신에 I (이노신)을 이용하는 경우가 자주 있다. 아미노산의 부분서열을 알고 그에 기초하여 primer를 합성할 때, 코돈의 중첩을 위해 혼합 primer를 합성해야 한다. 아미노산 배열에 따라서는 혼합의 정도가 높아져 바른 서열의 비율이 너무 낮아진다. 이 때 중첩해 있는 부분이 이노신을 이용하는 방법이 있다. 이 경우도 Taq polymerase를 사용해서 PCR을 실시하면 잘 증폭되지만 Pfu polymerase와 Vent polymerase에서는 증폭되지 않는다. 3’→5’exonuclease 활성을 가진 α형 효소는 기질 아나로그와 주형중의 이노신 대신 들어간 염기를 mismatch로서 제거해 버린다고 생각된다. 유일하게 3’→5’exonuclease 활성을 가진 Ultma polymerase를 사용했을 때 합성이 잘 된다는 보고가 있다.

 

(7) Long PCR

PCR로서 간단하게 목적의 DNA영역을 시험관 내에서 증폭할 수 있지만, 앞에서 언급한 바와 같이 증폭 서열의 정확성과 함께 PCR법이 갖는 또 하나의 큰 문제점은 증폭할 수 있는 DNA 영역의 길이에 제한이 있다는 것이다. 기존의 PCR에서 실제로 증폭할 수 있는 길이는 수 kbp 정도였고, α형의 DNA polymerase를 이용한 경우 그 실용성은 더욱 내려가, 2 kbp 이하가 된다. 주형-primer에 따라서는 반응조건을 최적화하므로서 10 kbp 이상의 증폭이 가능한 경우도 있지만, 일반적으로 긴 단편 DNA의 증폭은 곤란하다. 94년, 워싱턴대학의 Barnes가 발표한 Pol Ⅰ형 효소와 α형 효소를 혼합해 PCR에 이용한 방법은 상기의 문제점을 해결할 수 있는 획기적인 것이다. Taq polymerase로 PCR 반응을 실시했을 때의 증폭길이에 제약을 받는 원인으로 3’→5’ exonuclease 활성이 없어 잘못 읽은 경우에 3’말단이 mismatch 되어 그 후의 합성이 저해되는 것이라 생각되므로 3’→5‘ exonuclease 활성을 갖는 Pfu polymerase와 Vent polymerase를 혼합하여 PCR을 실시해 보면 극히 효과가 있을 것으로 판단, 실제로 실험한 결과, 간단히 10 kbp 이상의 DNA 증폭이 가능하게 된 것이다.

4. References

1) http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=435554&mobile&categoryId=577

2) PCR 기초강좌, 백전백승 PCR가이드/Takara

3) Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B., Erlich, H. A. (1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491.