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[Dyne 32rd 기초실험방] Norovirus 특성과 분석법

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작성자 다인바이오 작성일16-06-13 17:32 조회5,769회 댓글0건

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Norovirus 특성과 분석법



1. 정의

노로바이러스(Norovirus)는 지역사회에서 발생하는 위장관염의 가장 흔한 원인병원체 중 하나로 주로 겨울철에 발생하여 학교, 수련원,요양원, 병원, 유람선, 호텔과 같이 공간적으로 제한된 환경에서 발생하는 유행(epidemics)과 관련된 것으로 알려져 있다. 노로바이러스는 RNA 바이러스로, 칼리시바이러스(caliciviruses)에 속하며 그 동안 이름이 여러 번 변경되었다. 1972년 전자현미경 하에서 그 형태가 밝혀져, 이 바이러스가 바이러스 중에서도 작고 구형을 하고 있던 것에서 원형소체바이러스(small round-structured virus)라고도 하였으며, 그 후 비세균성 급성위장염의 환자로부터 Norwalk virus와 닮은 소형구형 바이러스가 잇달아 발견되었기 때문에 일시적으로 유사노워크바이러스(Norwalk-like virus)라고도 부르기도 하였다.

2. 특성

1) 생화학적 특성

노로바이러스는 Calicivirdae에 속하는 바이러스로 7.57.7 kb크기의 single-stranded RNA genome을 가지며 3개의 해독틀(open reading frame: ORF)로 구성되어 있다. 바이러스입자는 산이나 적당한 가열, 에테르(ether)에 저항성이 있으며 염화세슘(cesium chloride)에서 부력밀도가 1.33 g/cm3 ~ 1.41 g/cm3의 수치를 보이는 것으로 알려져 있다. 노로바이러스를 실온에서 pH2.73시간 동안 노출시키거나, 20% 에테르로 4에서 18시간 처리하거나, 60에서 30분간 배양시킨 후에도 감염력이 유지된다. 노로바이러스는 일반 수돗물의 염소 농도인 3.756.25 mg/L(잔류염소량 0.51.0 mg/L)에서도 불활성화 되지 않아 저항성이 강하며, 노로바이러스를 불활성화 시키기 위해서는 오염된 배수시스템의 처리 농도인 10 mg/L이상의 염소 농도가 필요하다(질병관리본부 건강정보).

2) 생육과 생존

(1) 생육(Growth)

​노로바이러스의 검출 및 확인은 DNA sequencing과 같은 분자적 방법(molecular methods)을 이용하여 수행한다.

(2) 생존(Survival)

온도

60, 30분 배양 후에도 감염성이 유지된다. 파스퇴르 저온살균법으로도 바이러스 제거가 충분하지 않다. 식품과 조개류에서 그 저항이 더 크다고 보고되고 있다. 냉장 및 동결 조건에서는 몇 달, 또는 몇 년 동안 감염력이 유지된다. 일반적으로 동결은 바이러스를 비활성화하지 않는다.

pH

pH 3~4의 위산에 견디며, pH 2.7, 3시간 동안 상온에 노출되어도 감염성이 유지된다. pH 9.0 이상에서는 민감하다고 알려져 있다.

건조(Drying)

건조한 조건에서 잘 견딘다. 노로바이러스는 식중독 발생 후 12일 까지 동일한 장소의 카펫 표면에서 발견된다.

보존제(Preservatives)

식품에서 증식하지 않기 때문에 보존제로 차단할 수 없다.

방사선(Radiation)

방사선 조사에 의한 영향은 알려진 바 없다.

3. 분석법

1) 검출방법 일반

상용화된 노로바이러스 항원 검출용 효소면역검사(Enzyme Immunoassays, EIA) 진단 kit가 개발되어 있으나, 효소면역검사 분석법은 노로바이러스 균주에 따라서 민감도가 달라지는 단점이 있다. 일반적으로 환자의 분변으로부터 바이러스 유전자를 직접 증폭하여 검출하는 RT-PCR, Realtime RT-PCR 방법이 널리 검출진단에 사용된다.

이외에 전자현미경 관찰이나 항체 조사방법 등으로 진단이나 유병률 조사를 수행하기도 한다.

노로바이러스는 유전자 변이가 심해 외국에서 검출된 바이러스를 기초로 한 연구결과를 국내에 그대로 적용시킬 수 없는 실정이다.

굴을 제외한 식품에서 노로 바이러스를 검출하는 공인된 검사법이 국제적으로 확립되어 있지 않으며, 환자 가검물에 대한 검사법만 확립되어 있다.


2) 식품용수 등의 노로바이러스 시험법(식품공전, 2010)

(1) 채수 및 유전자 추출

표준필터장치를 이용하여 식품용수를 채수한 후, 1.5% Beef extract 용액을 연동정량펌프로 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 분리한다. 원심분리기를 이용한 바이러스 농축 과정을 거친 후, 노로바이러스 RNA 유전자 추출(Viral RNA Mini Kits) 용액으로 유전자를 추출한다.

(2) 노로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

PCR로 노로바이러스의 유전자형(GIGII)을 각각 확인하기 위하여 유전자형에 따라 프라이머 조합을 달리하여 수행한다. PCRRT-PCR (Reverse transcription-Polymerase chain reaction)1PCR을 한 시험관에서 동시에 수행하는 One-step RT-PCR 법을 사용하고 2PCR에서는 반응 프라이머를 바꿔 Semi-nested PCR을 한다. PCR 반응이 종료된 후, 1.5% agarose gel 상에서 100V로 전기영동한 후 UV transilluminator로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(3) 1차 결과 확인

Agarose gel 상에서 시료에 313 bp의 밴드가 있을 경우 GI형 노로바이러스로, 310 bp의 밴드가 있을 경우 GII형 노로바이러스로 일차 확인하되, 양성대조군 GI 형은 689 bp, GII형은 686 bp로 확인되어야 한다.

 

(4) 최종 검출 판정

노로바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 agarose gel 상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 Sequencing 반응하여 최종 판정한다. 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2 GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M GII-R1Mprimer를 사용하여 sequencing을 수행한다. DNA Sequencing에 의해 결정된 염기서열은 노로바이러스 유전자 데이터베이스와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

 

3) 노로바이러스 자동화 진단시스템 (보건복지가족부, 2009)

(1) 노로바이러스 자동화 진단시스템의 구성 및 활용

노로바이러스 자동화 진단시스템은 자동화 핵산추출과 Real time RT-PCR을 활용한 유전자 증폭과 검출의 자동화 등 2단계로 이루어진다.

노로바이러스 진단을 자동화해 현재 17개 기관에서 수행 중인 노로바이러스 진단에 대한 시·도별 실험실 진단능력이 평준화되고 진단에 걸리는 기간도 50% 줄이는(13시간6시간) 등 신속한 진단이 가능해 대규모 발생이 생기더라도 조기에 진단할 수 있게 되었다.

(2) 노로바이러스 자동화 진단시스템과 기존 방법의 비교

핵산추출 과정 자동화 및 Real time PCR을 도입해 기존에 실험자의 손으로 하던 많은 과정들을 무인 자동화함으로서 실험자 및 실험실 간의 검사수준의 차이를 최소화하였다.

노로바이러스의 경우 현재까지 유전자검출법의 일종인 PCR법에 의존하고 있으나 PCR 진단법의 가장 취약점인 교차오염이 검사신뢰도 확보를 위한 가장 큰 문제다. Real time PCR의 경우 기존의 방법에 비해 민감도가 높고 밀폐된 반응액에서 수행하므로 실험실 교차오염을 최소화할 수 있는 최신의 진단법으로 보고되고 있다.






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