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[Dyne 26th 기초실험방] Apoptosis-caspase activity

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작성자 다인바이오 작성일15-01-16 11:48 조회11,963회 댓글0건

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Apoptosis 관련 assay



1.     Caspase Activity

대부분의 caspase(Caspase; Cystein-aspartic acid-protease)는 아포토시스의 유도에 관여하는 cascade cystein protease이며, 활성 부위의 cystein 잔기를 이용하여 기질 단백질의 aspartic acid 잔기 부위를 절단한다. Initiatorcaspase (Caspase-8, Caspase-9 )는 아포토시스 초기에 관여되어 있어 시그널 전달 경로의 상류로부터 개시 시그널을 받아 활성화된다. 불활성형 effector caspase(Caspase-3 ) initiator caspase 등에 의해 활성화되어 세포내의 다른 단백질을 분해하고 아포토시스로 진행한다.

초기 apoptosis에서는 caspase 반응이 일어나는 것을 볼 수 있다. 그 중 caspase3 tumor necrosis factor, cytotoxic T cell, CD95에 의해 일어나는 apoptosis에 필수적이다.

Caspase는 세포 내에서 apoptosis와 같은 생화학적 이벤트를 유발하는 중요한 요소이다. Apoptosis AssayCaspase 활성을 측정하는 것으로 다른 많은 방법들보다 빠르게 apoptosis를 확인할 수 있다.

Caspase 관련 assay로는 Apoptosis가 일어난 세포에서 절단이 일어난 물질을 확인할 수 있는 Western blot방법이 있다. Assay에서는 caspase Antibody, Anti-PARP가 사용되는데, 일부 caspase의 타겟 부위인 poly-ADP-Ribose Polymerase가 잘릴 경우 antibody를 이용해서 확인이 가능하다.

Caspase activity의 구체적이고 정량적인 측정을 위해서 Western blotting은 적합하지 않다. Caspase 절단 검출에 기초한 Caspase 활성을 수량화하기 위한 효소활성 assay가 최근에 개발되어왔다.


2.     Apoptosis 내에서 Caspase 역할, 기능, 과정

Apoptosis가 일어나게 되면 apoptosis억제 역할을 하는 Bcl2가 감소하고 apoptosis 를 촉진하는 Bax가 증가하게 된다.

 

세포사멸은 Caspase에 의해서 조절되는데 이 protease는 미토콘드리아에서 방출된 Cytochrome C에 의해서 활성화된다. Cytochrome C 는 미토콘드리아 내막에 결합하여 있다가 apoptosis가 일어나게 되면 세포질로 방출되어서 칼슘을 방출한다. Cytochrome C 가 증가하면서 Caspase 9을 활성화 시키고 caspase9 caspase3을 활성화 시키며 DNA repair 역할을 하는 PARP의 절단에 의해서 apoptosis가 일어나게 된다.

3.    Caspase 3 Activity Assay

 

Apotposis가 일어나면 Caspase가 절단되면서 활성화되는데, Caspase 3 Activity Assay 에서는 anti-caspase3 plate에 코팅한다. 플레이트에 apoptosis가 진행되어 active caspase 3가 포함된 샘플을 주입하고, 형광기질인 Ac-DEVD-AFC을 넣으면, Caspase3에 의해서 Ac-DEVD-AFC가 절단되어 DEVD가 떨어지면서 Free fluorescent AFC에 의해 형광을 나타내는데, Caspase3의 증가를 확인하면서 apoptosis를 확인할 수 있다. 이때, 형광물질은 활성화된 caspase3의 농도에 비례한다.

 

01m_3w그림1.jpg 

4.    M30 CytoDEATH, Fluorescein

세포사멸과정에서 상피세포내의 단백질 분해효소인 caspase들은 세포 내 기질을 구성하는 중간세사들의 중요 구성 성분 중 하나인 cytokeratin 18 (CK18)을 분열시켜 M30 항원 (CK18Asp396)이라는 절편들을 발생시킨다. M30 antibodyapoptosis가 된 샘플에 고정하면 잘린 부위를 인식해서 붙게 되고, M30 antibody에 형광물질이 붙어있어서 염색과정 필요 없이 시간을 절약할 수 있다. M30 CytoDEATH 항체에 의한 면역형광염색을 이용해 배양액 내로 유출된 M30 항원의 농도를 측정한다. M30은 정상세포에는 붙지 않고 세포막이 소실되면 배양액 또는 순환 혈액으로 유출되어서 사망의 생물학적 지표로도 이용이 가능하다.

Immunohistochemistry, Immunocytochemistry, Flow Cytometry 를 통해 확인할 수 있다.

 

M30 CytoDEATH M30 CytoDEATH, Fluorescein 실험 과정 차이

 

01m_3w그림2.jpg

5.     Caspase activity에 사용 할 수 있는 Assay

 

 

If you are studying

And you wish to detect

Using detection by

Then use

Caspase Activity

Cytokeratin 18

Western blot,

Flow cytometry,

Fluorescence microscopy,

Light microscopy

M30 CytoDEATH

M30 CytoDEATH,

Fluorescein

Caspase 3 activity

Fluorescence ELISA

Caspase 3 Activity Assay

Caspases

Fluorescence ELISA

Homogeneous Caspases Assay, fluorimetric

Caspase cleavage

of PARP

Western blot,

Immunoprecipitation,

immunohistology

Anti-Poly(ADP-Ribose) Polymerase(PARP)

 

6.   Reference

- Apoptosis, cytotoxicity and cell proliferation 4th edition/ Roche

- Sang Ho Park, M.Sc.1, Hyun Sung Kwack, M.D.2. Measurement of apoptosis using M30 in culture media of cell lines treated with anticancer agents. Korean Journal of Obstetrics and Gynecology Vol. 53 No. 5 May 2010

 

 






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