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[Dyne 1st 기초 실험방] PCR 기본 원리

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작성자 다인바이오 작성일12-07-30 10:51 조회35,464회 댓글0건

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PCR (Polymerase Chain Reaction)

1. 정의

DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 기술

 

2. 원리

Double strand DNA denaturation step, primer와의 annealing step, polymerase에 의한 DNA synthesis step을 반복하여 실시함으로써 시험관 내에서 DNA를 증폭하는 방법이다.

극히 단순하고, 쉽게 응용할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학 뿐만 아니라 고고학이나 인류학에 이르는 분야까지 그 활용범위를 넓혀가고 있다.

 

3. 반응조건


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Fig. 1. The different steps in PCR.

 

 1) DNA 변성 (Denaturation)

: 두가닥 DNA 94℃에서 15~30초간 처리하여 각각 한가닥 DNA로 분리시킨다. 너무 온도를 높이거나 처리 시간을 지나치게 늘리면 내열성 DNA polymerase 활성을 잃게되므로 주의가 필요하다.


 
2) Primer
annealing

: 열처리로 한가닥으로 변성한 DNA primer는 온도를 낮추면 2종류의 primer는 각각 상보적인 한가닥 DNA annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30~1분간 한다. Annealing 온도를 높이면 primer-주형 DNA mismatch가 감소되어 반응 특이성이 높아진다. 그러나 혼합 primer 또는 mismatch를 갖는 primer를 사용할 경우는 37~45℃로 온도를 낮출 필요가 있다.

 

 3) 신장반응 (Extension)

: 4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서 30~10분간(증폭크기 약 10kbp)처리한다. Taq. Polymerase에 의한 DNA 합성속도( 60 nucleotides/sec, 70)를 고려하여 시간을 설정한다.

최근 primer annealing 단계, 신장반응 단계를 동일한 온도에서 하는 shuttle PCR도 실행되고 있다.

    )  94      30 (변성단계)

         60~68  1~10(annealing, 신장단계)

         24~40 cycles

Shuttle PCR을 함으로서 반응시간을 단축하고 고온에서 annealing하기 때문에 특이성이 높은 PCR을 기대할 수 있다. 긴 크기(5 kbp 이상)의 증폭에는 shuttle PCR이 적합하다.


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Fig. 2. The exponential amplification of the gene in PCR.

 

4. PCR 증폭 효율에 영향을 미치는 요인


1)
각 단계의 반응온도와 시간

 
2) cycle

  : PCR의 경우 n회의 cycle로 배적배열은 2n배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 ① DNA polymerase의 활성 저하 및 증폭단편(주형DNA)의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족, ② 증폭단편간의 annealing 되는 속도가 빨라져서 primer annealing과 경합. Phosphate 축적으로 인한 효소반응 저해 등이 일어날 수 있다. 일반적으로 25~35 cycles의 반응이 이루어지지만 증폭산물이 증가되면 그 자신이 primer가 되어 2차적인 반응이 일어나기 쉬우므로 비특이적인 DNA의 증폭을 일으키게 된다. 따라서 반응 cycle 수를 불필요하게 증가시키는 것은 바람직하지 않다.

 

3) 반응액 조성 (주형 DNA, dNTP 농도, Mg2+농도 등)


  i)
주형 DNA, RNA

: PCR법은 여러 가지 형태의 DNA RNA를 주형으로 하여 사용할 수 있다. 가장 간편한 DNA 조제법으로는 소수의 조직배양 세포를 비등한 증류수 속에서 가용화하여 PCR에 사용하는 방법이다. 또한 사람의 한 가닥의 머리털로부터 PCR 증폭하는 다형분석, 포르말린으로 고정한 파라핀포매조직 조작으로 PCR도 실시하고 있다. 혈액에서 주형 DNA를 조제할 때는 헤모글로빈이나 포르피린 기타 미지물질이 PCR 반응을 저해하는 점에 주의가 필요하다. 최근 법의학 분석에서 전혈 또는 머리털을 마이크로파 처리하여 그대로 PCR에 이용한다는 보고도 있다.

 

ii) dNTP

: PCR의 효율, 특이성면에서 보면 20~200μM에서 양호한 결과를 얻을 수 있다. DNA polymerase가 잘못된 dNTP를 사용하는 mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존한다. dNTP 농도를 낮추는 쪽이 PCR 특이성과 정확도가 높아지므로 dNTP 농도를 낮추면 misprimming이 감소하여 PCR의 정확도가 높아진다. , 사용하는 Mg2+농도에 다라 dNTP의 최적농도가 달라지므로 주의가 필요하다.

 

iii) Mg2+농도

: 일반적으로 PCR반응에서는 1.5~2.5mM Mg2+농도가 필요하다. Mg2+농도는 PCR을 실행할 때 다음의 사항에 관여하고 있는 것으로 여겨진다. ① 효소활성, primer annealing, ③ 합성된 DNA의 고충실성 (high fidelity), primer-dimer의 형성 등이다. 킬레이트제(ex. EDTA)는 반응액 속의 Mg2+농도에 영향을 미치므로 주형으로 사용하는 DNA 용액에서 turn over하는 것에 주의할 필요가 있다. 또한 유효한 Mg2+농도는 dNTP 농도와도 관계가 있으므로 어느 실험에서나 최적 Mg2+농도를 결정하고자 할 경우 항상 dNTP 농도를 고려해야 한다. 일반적으로 Mg2+농도가 높아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미칠뿐만 아니라 두가닥 DNA 변성이 어려워지고, Taq polymerase 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받게되므로 MgCl2를 과잉 첨가하는 것은 바람직하지 않다.

 

4) primer 설계

 : PCR로 유전자의 특정영역을 증폭하려면 primer가 되는 2종의 합성된 한가닥(single strand) DNA가 필요하다. Primer의 설계와 그에 대응하는 재조건 설정이 PCR의 성패를 결정한다고 해도 과언이 아니다. Primer 설계상 주의할 점은 길이, primer간의 상보성, GC 함량, primer 내의 2차구조, Tm , 사용농도 등이 있으나, 현재는 primer 설계용 컴퓨터 프로그램도 시판되고 있다.

 

5) 내열성 DNA polymerase

: DNA 중합효소는 말 그대로 DNA를 합성할 수 있는 효소로서, 개발 초기에는 대장균의 DNA 중합효소를 사용했다. 하지만 고온, 저온을 왕복하는 과정 때문에 고온에서 DNA 중합효소가 변형되어, 매번 새로 넣어 줘야 하는 불편함이 있었다. 이를 개선하여 호열성 세균인 Thermus aquaticus에서 얻은 Taq 중합효소를 이용하여 변형 문제를 해결하였다. 하지만 Taq 중합효소는 DNA 중합에 오류가 빈번히 일어난다는 문제가 있기 때문에, 현재는 고세균 Pyrococcus furiosus에서 얻은 Pfu 중합효소와 Taq 중합효소를 혼합하여 PCR법에 주로 이용하고 있으며 다른 중합효소도 널리 이용된다.

수 종류 내열성 DNA polymerase가 시판되고 있는데 반응에 사용하는 완충액의 조성이 다를 수 있으므로 주의가 필요하다.

 

6) 기타 몇 가지 반응첨가물 (DMSO, 비이온계면활성제, glycerol)

: 많은 염기배열을 복수의 primer set를 사용하여 동시에 1개의 반응 tube 내에서 PCR 증폭하는 방법을 다중 PCR (multiplex PCR)이라 한다. 근육병의 원인인 디스트로핀 유전자의 결실변이를 18종류의 primer를 사용하여 검출할 수 있다. 일반적으로 multiplex PCR반응액에는 10%(v/v) dimethylsulfoxide (DMSO)를 함유한다. 유기용매는 보통 Taq polymerase에는 적합하지 않지만 multiplex PCR에는 필수적이다. Taq polymerase의 저해물질로서 SDS(<0.01%)가 알려졌으나, 비이온계 계면활성제 Tween-20이나 nonidet-P40의 첨가로 그 저해를 억제할 수 있다. 또한 DMSO(2~5%), PEG6000(5~15%), glycerol(5~20%), formamide(5%) BSA(bovine serum albumine)첨가로 반응 촉진효과를 얻을 수도 있다.

 

5. References

- PCR 기초강좌, 백전백승 PCR가이드/Takara

- http://100.naver.com/100.nhn?docid=775411

- http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html





 






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