[Dyne 24th 기초실험방] 조직 표본 제작법

조직 표본 제작법

1. 조직검사학(histotechnology) 이란?

조직의 형태관찰을 위해 필요한 현미경적 표본제작기술(microtechnic)을 연구하는 학문이다. 조직을 연구하는데 있어서 가장 흔히 쓰는 방법은 광학현미경으로 관찰할 수 있는 조직표본을 만드는 것이다.

 

2. 경화방법에 따른 이용상의 특징

 

3. 일반조직의 표본 제작법

검체의 채취 → 육안 조직검사 → Fixation (고정) → Decalcification (탈회) → Tissue capsuling (조직 교갑) → washing (수세) → Dehydration (탈수) → Cleaning (투명) → Inpregnation or Infilteration (침투) → Embedding (포매) → Trimming (삭정) → Microtome cutting (박절) → Stain (염색) → Mounting (봉입)

 

1) 조직검체 채취

2) 육안조직검사 (육안으로 장기나 조직의 이상여부를 확인하고 검경을 위한 표본제작용 검체물 채취)

3) 검체를 고정 (검체를 고정액에 담궈서 고정)

4) Tissue capsuling (라벨과 조직을 카세트에 싸는 작업)

5) 수세 (흐르는 물로 고정액 제거)

6) 자동 조직 과정 처리기 (탈수, 투명, 침투)

7) 포매 (Paraffin block 제작, 삭정도 포함)

8) 박절 (Microtome으로 4-6micron 박절)

9) Slide 건조 (60℃ oven에 1시간 동안 건조시킨다.)

10) 염색 (일반 H&E stain 및 Special stain)

11) 봉입 (봉입제로 봉입 하여 조직 표본의 손실을 방지)

12) 판독 (현미경으로 검경하여 판독)

 

4. 고정(Fixation)

1) 고정의 의의

절취된 조직을 물리, 화학적 방법을 이용하여 조직의 변화를 방지하고, 조직의 구조와 성분을

보존하고, 표본제작의 적합한 상태가 되도록 인위적으로 변형시키는 과정을 고정(fixation)이라 한다.

 

2) 고정의 목적

자가융해의 방지하고 조직내 화학물질의 용해 및 소실 방지, 미생물에 의한 부패 방지, 조직손상의 방지, 염색에 대한 매염작용을 하기 위해 고정을 한다.

 

3)고정제의 종류

①     포름알데히드 (Formaldehyde: HCHO)

-       37～40% 수용액을 formalin 이라 한다 (장시간고정 시 암갈색의 색소 침착).

-       Formalin 고정용액은 formalin 10㎖에 D.W 90㎖의 비율로 희석하여 사용한다.

 ∴ 원래 4% formalin이지만 혼동을 피하기 위해서 보통 10% formalin이라 한다.

 

②     글루타알데히드 (Glutaraldehyde: (CH₂)₃‧CHO‧CHO)

-       전자 현미경의 1차 고정액으로 사용하고, 2차로 사산화 오스뮴(Osmium tetroxide)에 고정한다.

 

③     승홍 (Mercuric chloride: HgCl₂)

-       백색의 결정체로 물에7%로, 알콜에는33%정도로 용해된다

-       승홍은 강력한 단백질 침전능력이 있으며, 조직의 침투가 빠르고 조직을 단단히 만든다.

-       단점: 수은 색소가 침착된다 (염색성이 결여됨).

 ∴옥도화(iodized) 과정을 거쳐야 한다.

 

④     중크롬산 칼륨 (Pot.dichromate: K₂Cr₂O₇)

-       임계pH(pH3.4～3.8)보다 약간 산성의 경우는 세포질이 일정하게 고정되고, 사립체가 잘 

보존되지만, 핵 단백질은 보존 안 된다.

 

⑤     크롬산 (Chromic acid: H₂CrO₄)

-       강력한 산화제로 작용한다 (GMS 염색 시 산화제 역할을 함).

-       alcohol 이나 formalin 과 함께 사용하면 안 된다.

-       반드시 수세하여야 침전물 형성을 막는다.

 

⑥     피크린 산 (Picric acid: C₆H₂(NO₂)₃OH)

-       노란색의 결정체로 폭발하는 특성이 있어서 수분상태로 취급한다.

-       세포질의 염색성을 높이고, 당원을 고정하는데 이용된다.

-       AFB stain시 대조염색으로 methylene blue로 사용하지만, picric acid을 써도 무방하다.

 

⑦     사산화 오스뮴 (Osmium tetroxide: OsO₄)

-  매우 고가이며, 0.5～1% 수용액으로 사용한다.

-  전자 현미경적 2차 고정제이다.

 

⑧     초산 (Acetic acid: CH₃COOH)

-       염색체는 잘 고정되지만 지방질과 탄수화물 고정은 피한다.

 

⑨     에틸 알코올 (Ethyl alcohol)

-       무수 알콜은 투명제인 Xylene과 잘 섞인다, 적어도 70%이상의 것을 사용한다.

-       효소와 lipase 검출 시 관계되는 조직화학적 방법과 면역 형광 방법에도 이용한다.

 

          ⑩ 아세톤 (Aceton: CH3COCH3)

- 휘발성이 강한 무색의 액체로 효소증명 시 또는 면역화학적 검사 시 고정용액으로 사용.