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[Dyne 23rd 기초실험방] Quantitative Real-Time PCR (2)

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작성자 다인바이오 작성일14-06-27 18:57 조회19,288회 댓글0건

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Quantitative Real-Time PCR (2) 

 

 

1. 검출 방법의 종류

이번 내용에서는 Real-Time PCR에 더 많은 실제적인 문제를 탐구하고자 한다. 우리는 single plex 또는 multi plex 분석의 각 검출 방법의 종류와 원리를 설명하고, 본 실험 설계에 도움이 되고자 한다.

 

2. Real-Time PCR 위한 실험 디자인 설계

Real-Time PCR을 설계하는 첫번째 단계는 Singleplex 또는 Multiplex를 사용하냐는 것이며, 다른 하나는 어떤 종류의 chemical을 사용하냐는 것이다. 다음 내용에서 우리는 분석의 각 유형을 설명하고 실험에 대한 최고의 유형을 선택하는 방법에 대하여 제공한다.

 

1) Singleplex 또는 Multiplex

현재는 Real-Time PCR 기기의 성능에 따라, 하나의 tube에서 최대 다섯개 까지의 다른 target gene을 증폭하고 정량 할 수 있다. MultiplexSingleplex에 비해 다음과 같은 장점을 가지고 있다.

Sample의 양이 제한적일 때에도 여러가지 target gene의 발현을 볼 수 있다.

② 하나의 tube에서 증폭산물을 비교하므로 증폭산물 간의 오차를 줄 일 수 있다.

③ 하나의 tube에서 증폭시키므로 시약의 비용을 감소 시킬 수 있다.

Sample 오염의 위험이 줄어든다.

이러한 고려 사항들 중에 분석에 중요한 것이 없다면 singleplex로도 충분하다.

 

2) 검출 방법의 원리

형광표식 probe에는 크게 세가지로 나눌 수 있는데, DNA-binding agents에는 SYBR Green, Hydrolysis probes에는 TaqMan probe Beacons, Scorpions 그리고 Hybridization probes에는 Light Cycler가 있다. 일반적으로 SYBR Green을 가장 많이 사용한다.

 

DNA-binding agents (SYBR Green)

SYBR Green I Double strand DNA 결합하여 형광을 나타내는 시약 (interchelator)이다. Interchelator PCR 반응으로 합성된 double strand DNA 결합하여 형광을 발하며 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 있다.

 

Hydrolysis probes (TaqMan, Beacons, Scorpions)

Reporterquencher가 인접하여 제작된 probereporterfluoresencequencher가 흡수한다. Taq polymerase에 의해  probe가 분해시 Reporterquencher가 분리되어 reporter에 의해 fluoresence가 발생하게 된다.

 

 
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Fig. 2-2-1. DNA-binding dyes in real-time PCR. Fluorescence dramatically increases when the dye molecules bind to dsDNA.

 

 

 TaqMan probe법은 5말단은 형광물질(FAM ) 3말단은 quencher 물질 (TAMRA )로 수식한 oligonucleotide (TaqManTM probe) PCR 반응액에 첨가하는 방 법이다. TaqManTM probe annealing step에서 template DNA 특이적으로 hybridize하지만, probe상에 quencher 의해 형광 발색이 억제된다. Extension 반응 시에 Taq DNA polymerase 갖는 5’→ 3exonuclease 활성으로 template hybridize TaqManTM probe 분해 되어 형광색소가 probe에서 유리되면서 quencher 의한 억제가 해제되어 형광을 나타낸다.

 

Hybridization probes (Light Cycler)

Probe를 두개를 디자인 하여 한쪽에는 Donor Dye (3’), 다른 한쪽 probe에는 acceptor Dye (5’) 를 붙여서 Annealing 단계에서 Detection 된다.

 

3. SYBR Green VS. TaqManb Probe

우리는 실험의 목적에 맞게 형광표식 probe을 선택해야 한다. 이번 장에서는 가장 대표적으로 사용되고 있는 SYBR Green TaqMan Probe의 장단점을 비교하고자 한다.

SYBR Green은 사용하기 편리하고 상대적으로 TaqMan Probe보다 저렴하다. 그리고 sensitive하며, melting curve analysis에 용이하다 하지만 모든 Double strand DNA 결합하여 형광을 나타내므로 non-

 


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Fig. 2-2-2. TaqMan assay.

 

 

 

 


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Fig. 2-2-3. Hybridization probes.

 

 

specific binding가 생길 확률이 TaqMan Probe에 비해 높다.

TaqMan Probetemplate DNA 특이적으로 hybridize하면서 형광을 나타내기 때문에 specificity하며, various fluorophores하다. 하지만 probe design 해야 하는 번거로움이 있으며, one targetspecific하다. 그리고 SYBR Green에 비해 상대적으로 비싸다.

위와 같은 장단점을 비교하여 사용하고자하는 목적에 맞게 선택하여 실험에 이용하는 것이 좋다.

 

4. Primer 설계

Real time PCR 실험의 첫번째 단계는 목적 유전자를 검출할 있는 primer ( probe) 선택이다. 전용 소프트웨어를 이용하여 직접 설계 할 수도 있고 설계가 끝난 것을 구입해서 사용할 수도 있다.

Primer 설계는 Real time PCR 성공시키기 위한 가장 중요한 요소로, PCR 증폭효율이 나쁜 primer로는 고감도 검출이 불가능하고 primer dimer 비특이적 증폭이 발생하기 쉬운 primer로는 정확한 정량이 어렵다.

Primer 설계 전용 소프트웨어를 사용하여 다음과 같은 조건을 만족하는 primer를 설계하는 것이 중요하다. ① 표적 DNA 서열에 안정되게 annealing 할 수 있다 (Tm값이 적절한 범위). ② PCR 반응효율이 좋다(Primer 내부 혹은 primer갂에 상보적인 서열이 없다). ③ 특이성이 높다 (template DNA상에 mis-priming하는 부위가 없다) 당사의 Real time PCR 지원 시스템은 여러 가지 조건을 고려해서 설계된 primer (Interchelating법에 의한 Real time RT-PCR) custom 합성하는 서비스이다. Human, Mouse, Rat RefSeq에 대해 많은 Primer Set가 준비되어 있어 list에서 선택해서 구입하기만 하면 즉시 실험할 수 있는 편리한 시스템이다. 시판 primer custom 설계 서비스도 이용할 수 있다. , 검출에 형광표식 probe를 사용하는 경우에는 primer probe의 상호작용이 검출효율에 영향을 미치는 경우가 있으므로 primer probe를 동시에 설계하는 것이 좋다. 설계 방법은 probe의 종류에 따라 달라지며, 각각 전용 소프트웨어를 사용한다.

5. References

- Real-Time PCR Applications Guide/Bio-Rad

- PCR 기초강좌, 백전백승 PCR가이드/Takara

- 처음 하는 Real time PCR/Life Science & Biotechnology

 

 






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