[Dyne 19th기초 실험방] Working with DNA (2)

 

* DNA 분자량 marker의 Fragment Size

2.1. OD 측정을 통한 DNA의 농도 및 순도 확인

1) DNA의 농도

•    1 A₂₆₀ Unit of dsDNA = 50 μg/ml H₂O

•    1 A₂₆₀ Unit of ssDNA = 33 μg/ml H₂O

•    OD 값은 0.1과 1.0 사이의 범위가 적합하다.

<ex.>

- volume of dsDNA sample: 100 μl

- dilution: 25 μl of this sample + 475 μl H₂O (1+19 dilution)

- A₂₆₀ of this dilution: 0.44

- concentration of dsDNA in sample: 0.44 x 50 μg/ml x 20

(=dilution factor) = 440 μg/ml

- amount of dsDNA in sample: 440 μg/ml x 0.1 ml (= sample volume) = 44 μg

2) DNA의 순도

•        Pure DNA: A₂₆₀/A₂₈₀≥ 1.8

•        A₂₆₀/A₂₈₀ < 1.8는 시료가 단백질과 방향족 물질(ex; 페놀)로 오염되어 있음을 나타낸다.

•        A₂₆₀/A₂₈₀ > 2 는 RNA에 의해 발생할 수 있는 오염을 나타낸다.

•        OD 값은 DNA의 크기에 대한 정보를 제공하지 않는다.

2.2. 제한 효소; 일반 정보

1) Unit 정의

•    제한 효소 1 unit은 각각의 제한 효소에 해당하는 분석 조건에서 60분 동안 1μg의 기질 DNA를 완전히 분해하는 데에 필요한 효소의 양이다.

2) 보관

•    제한 효소는 모든 단백질과 유사하게 변성에 민감하고, 높은 온도에 노출될 때 specific activity를 잃을 수 있다.

•    따라서, 효소는 glycerol solution으로 제공되며, non-defrosting freezer에서 -15~-25℃에 보관되어야 한다.

•    사용 중에는, 효소를 ice 또는 특별히 개발된 benchtop cooler에 보관하는 것이 좋다.

2.3. 제한 효소; Star Activity

1) 정의

•    최적이 아닌 조건에서의 제한 효소의 DNA sequence 절단 능력은 그 효소의 인식 부위와 유사하지만 동일하지는 않다.

•    다음의 효소들은 어떠한 최적이 아닌 조건 하에서 Star Activity를 나타낼 수 있다

BamH I, BssH II, Dde I, EcoR I, EcoR V, Hind III, Hinf I, Kpn I, Mam I, Pvu II, Sal I, Sau3A I, SgrA I, Taq I 

•        그러나, Nasri, M. et al.의 보고에 의하면 Star Activity는 모든 제한 효소의 일반적인 특성이 될 수 있다.

2) Star activity를 일으키는 요인

•    높은 glycerol 농도 (> 5% v/v).

•    과량의 효소 사용

•    Buffer system의 최적이 아닌 이온 강도, pH 및 2가 양이온

•  유기 용매의 존재
3) Star activity의 방지

•    공급자가 권장하는 각 효소에 대한 최적의 buffer를 사용한다.

•    공급자가 권장하는 각 효소에 대한 최적의 양만큼 사용한다.

•    DNA prep. 시 DNA의 분리/정제에 사용될 수 있는 유기 용매가 함유되지 않도록 한다.

 

2.4. 제한 효소; inactivation and removal

- 다음 절차는 제한 효소를 불활성화하기 위해 적용할 수 있다.

1) Inactivation

•    열처리 : 특정 효소는 가열에 의해 불활성화 시킬 수 있다.

•    EDTA 처리 : 다른 방법으로, 효소는 0.5M EDTA(pH 8.0)를 10mM의 최종 농도로 첨가함으로써 불활성화될 수 있다.

2) Removal

•    Phenol/chloroform 추출 : phenol/chloroform 및 chloroform으로 샘플을 추출하고, ethanol 또는 iso-propanol로 DNA를 침전한다.

•    Silica 흡수 : 번거로운 phenol/chloroform 추출 과정 대신, 시중에 나와있는 정제 키트를 이용할 수 있다.

※ Reference

- http://www.roche-applied-science.com/labfaqs

 

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