[Dyne 17th 기초실험방] WST-1 Cell Proliferation Assay

WST-1 Cell Proliferation Assay

(주)다인바이오 연구소

살아있는 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의한 WST-1의 변환

그림 1. Tetrazolium salt WST-1 (4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate)이 formazan으로 변환 (EC: electron coupling reagent, RS: mitochondrial succinate-tetrazolium-reducatase system).

(1)  시약 및 장비

1)시약 및 장비

DMEM, Trypsin-EDTA, WST-1, 시험물질 (chemical)

2)고정장비류Clean bench, CO₂ incubator, microscope, centrifugal separator, vacuum pump, suctioning apparatus, ELISA reader

(2) 실험방법

1) 동물세포 배양 배지를 vacuum을 통해 완전히 제거한다.

2) Trypsin-EDTA 처리 후 10분간 방치한다 (trypsin-EDTA의 처리시간은 동물세포의 종류마다 다르므로 현미경으로 관찰한 다음 처리시간을 결정).

3) DMEM 배지를 첨가한 trypsin-EDTA 와 1:1 비율로 넣어 trypsin-EDTA를 불활성화시킨다.

4) 15 ml conical tube를 원심분리기에 넣고 1200rpm에서 10분간 원심분리를 한다.

5) Pellet을 제외한 상층액을 제거한 후에 배지를 첨가해 pellet을 조심스럽게 풀어준다.

6) Hemacytometer에 10 μl을 넣고 세포의 수를 세어 평균을 낸다.

7) Microplate에 최종 배양액이 100 μl/well 되도록 세포를 배양한다.

배양시간이나 배양 세포농도는 각 실험 조건이나 이용하고 있는 세포 타입에 따른다. 대부분의 실험에서의 세포농도는 0.1~5X10⁴개/well, 배양시간은 4~96 시간이 적당하다.

Ex) 130.5개 ×10⁴× V = 5×10⁴× 4ml, V= 0.15ml + DMEM 3.85 ml

8)     Well에 넣어줄 chemical을 농도별로 희석/제조하여 각 well에 첨가해준 후 1~3일 동안 배양한다.

9)     세포배양이 끝난 후, premix WST-1을 각 well당 10 μl씩 첨가하여 동일한 배양조건으로 0.5~4시간 배양한 뒤 ELISA reader를 이용하여 background control에 대한 sample의 흡광도를 측정한다. Formazan 산물의 흡광도를 측정하기 위한 파장은 ELISA reader의 filter에 따라 420~480nm 사이이며 (최대 파장은 약 440nm, 그림 2), 대조 파장은 600nm 이상이 좋다.

l  Background control: 1번에서 사용한 배양배지 + WST-1을 10ul 섞어, 이것을 ELISA reader의 background control (세포가 없는 배양배지 + WST-1의 흡광도)로서 이용한다. 세포가 없는 배양배지에 WST-1을 더한 경우에도 배지, incubation 시간, 빛에서의 노출 때문에 미약한 흡광도가 측정될 수 있다. 2시간 후의 일반적인 background 흡광도는 0.1~0.2 사이이다.

          A.                                                                               

WST-1 첨가 후의 반응시간 (incubation time)은 각 실험 (세포의 종류나 농도)에 따라 다르므로 WST-1을 첨가한 후, 다양한 반응시간 (예를 들면, 0.5, 1, 2, 4시간)에서 흡광도를 반복 측정하여 최적 반응시간을 결정한다. 높은 감도를 원하는 경우, WST-1 존재하에서 세포를 보다 오랜 시간 반응하면 된다. 세포내 탈수소효소에 의해 WST-1이 formazan 색소로 변환되어 발색강도가 증가한다.

(4)   MTT, XTT, MTX 시약 (tetrazolium salt)과 WST-1 cell proliferation assay system 차이 (그림 3)

그림 3. A. MTT (▲), XTT (■), Cell Proliferation Reagent WST-1 (●)의 비교. P815 cell은 다양한 tetrazolium salts를 첨가하기 전에 20시간 동안 배양하였다. 4시간 기질 반응 후에 ELISA reader로 흡광도를 측정한 결과. B. Cell Proliferation Reagent WST-1의 대사동역학 (kinetics of the metabolism). 다양한 Cell proliferation Reagent WST-1을 첨가하기 전 20시간 동안 배양한 A549 cells를 타나내는데, 0.5시간 (●), 1시간 (■), 2h(▲), 4h (▼)동안 incubation한 후의 흡광도를 ELISA reader로 측정한 결과.

ü  http://cms.takara.co.kr/file/lsnb/45_14-15.pdf

ü  https://cssportal.roche.com/LFR_PublicDocs/ras/11644807001_en_12.pdf

ü  http://arthritis-research.com/content/4/S3/S197/figure/F6

ü  Ishiyama, M. et al. (1995) In vitro Toxocology 8,187-189.

ü  Ishiyama, M. et al. (1993) Chem. Pharm. Bull. 41, 1118-1122.

ü  Shirahata, S. et al. (1995) Biosc. Biotech. Biochem. 59(2), 345-347.

ü  Teruya, K, et al. (1995) Biosc. Biotech. Biochem. 59(2), 341-344.

ü  Takenouchi, T. et al. (1995) Life Sciences 56, 479-484.

ü  Liu, SO et al. (1995) Nature Medicine 1, 267-271.

ü  Ishiyama, M. et al. (1995) Analyst 120, 113-116.

ü  Iwaki, T. et al. (1995) Brain Research 673, 47-52.

ü  Yano. T. et al. (1994) Cytotechnology 16, 167-178.