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[Dyne 16th 기초실험방] 세포증식 및 사멸도 변화 평가

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작성자 다인바이오 작성일13-11-29 13:47 조회9,378회 댓글0건

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세포증식 및 사멸도 변화 평가 

 

 

1. 정의 및 목적

살아있는 세포를 정확하게 측정하여 세포의 증식 또는 사멸도 변화를 평가하는 실험은 생명과학 분야에서 필수적인 실험 중의 하나이다. 특정 물질에 대한 효능 및 생리활성을 평가하거나 새로운 약품을 개발하기 위해서는 동물실험과 생체 적용 단계 이전에 세포 내에서 독성 및 활성 변화 또는 약물의 종양세포 성장억제력 등을 알아보는 과정을 거쳐야 한다.

살아있는 세포를 측정하는 가장 직접적인 방법은 세포에 trypan blue 등을 처리하여 염색한 후 현미경과 hematocytomerer를 이용하여 생존세포수를 측정하는 방법이다. 하지만 검체수가 많을 시에는 측정시간과 노력이 많이 소요되고, 부정확한 결과를 가지고 올 수 있어 직접적인 방법을 사용하기 어렵기 때문에 이를 대체하기 위한 여러가지 방법이 개발되고 있다. 세포수를 쉽게 측정할 수 있는 kit등도 많이 개발되고 있어 예전보다 간편하게 세포의 증식 및 사멸도 변화에 관한 평가를 진행할 수 있다.

2. Tetrazolium salt assay의 원리

세포 증식 및 사멸도 변화를 측정하는 데에 현재 많이 사용하고 있는 방법은 MTT, MTS, WST-1, XTT 등 여러가지 tetrazolium salt를 이용한 방법이다. Tetrazolium salt 3개의 aromatic ring이 연결된 heterocyclic compound의 통칭이며 환원형 화합물 또는 dehydrogenase 등의 효소에 의해 쉽게 환원되어 formazan을 형성하고, 발색을 일으킨다. tetrazolium salt의 기본 구조에 결합된 aromatic ring 구조의 종류에 따라 수용액에서의 용해도와 흡광도가 달라진다. 대사적으로 왕성한 활동을 하고 있는 세포는 미토콘드리아의 전자전달계 과정을 통하여 생존에 필요한 에너지를 생산하는데, tetrazolium salt를 이용한 assay는 전자전달계에 존재하는 탈수소효소가 tetrazolium salt를 분해하여 formazan을 생성하는 원리를 이용하며, 이를 통해 살아있는 세포를 정량적으로 평가할 수 있다. assay96-plate well을 사용하고 검사결과를 ELISA reader를 이용하여 측정하므로 많은 시료를 비교적 빠르고 정확하며 객관성있게 판독할 수 있어 배양세포를 이용한 세포활성 및 독성평가에 널리 사용되어지고 있다.


3. MTT assay 원리 및 실험 방법

MTT 시약을 이용하는 tetrazolium assay는 노란색의 수용성 MTT tetrazolium을 세포에 처리하면, 살아있는(대사 과정이 온전한) 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 tetrazolium ring 구조가 끊어지면서 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan 결정으로 환원되는 원리를 이용한다. MTT formazan 결정은 일반적으로 dimethyl sulfoxide(DMSO)와 같은 유기용매에 녹여 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하는데, 이때 formazan dye의 흡광도는 540nm 부근이다. 이 흡광도는 MTT가 살아있는 세포에 의해 환원된 양을 나타내며, well에 존재하는 생존 세포 수와 비례한다. 살아있는 세포가 많을수록 MTT fomazan이 많이 생성되므로 formazan dye의 흡광도가 높게 측정된다. 이러한 원리를 이용하여 측정된 흡광도에 따라 살아있는 세포를 정량적으로 평가할 수 있다. , 측정 well당 세포의 농도가 너무 낮거나 높은 범위에 있으면 살아있는 세포의 농도와 흡광도 사이의 직선적인 비례관계가 성립되지 않게 되므로 최적의 세포농도를 결정하는 과정을 거쳐야 한다.

 


[ 장점 ]

  간편하면서도 정확하게 세포 증식 및 사멸도 변화 평가.

Multi-well plate 이용하여 대량의 시료 동시에 측정 가능.

 

[ 단점 ]

Formazan 용해 위해 유기용매 사용.

DMSO 처리 위한 배지 제거과정에서 세포 손실 위험. Suspension cell 처리에 어려움.

세포의 생리적 상태나 세포의 종류에 따라 미토콘드리아 탈수소효소의 활성 차이 나타날 수 있다.

[ MTT 시약 제조 (MW : 44.33)]

• 5mg/mL의 농도로 PBS에 녹여 사용한다.

시약이 PBS에 잘 녹지 않으므로 sonication 25분 정도 해주고, 완전히 녹으면 0.2㎛ 정도로 filtering 하여 사용한다.

• MTT 시약은 빛에 약하므로 호일을 씌우거나 빛을 차단하여 보관한다.

 

[ 실험 protocol ]

① MTT 시약을 serum free media10배 희석한다. (호일로 감싸둔다.)

10mL 제조 시 ⇒ MTT 시약 1mL + media 9mL (96-well plate10ml 필요, well100μL씩 분주)

이때 media FBS가 포함되지 않은 media를 사용한다.

미리 물질을 처리해둔 세포를 준비한 뒤, well에 있는 media를 조심스럽게 제거한 후 MTT 시약을 100μL씩 처리한다.

MTT 시약을 처리할 때는 충분히 섞어주면서 처리한다.

MTT 시약을 세포에 처리할 때 너무 세게 넣으면 세포가 손상되므로 천천히 넣어준다.

시약 처리 후 37℃에서 1시간 incubation 해준다.

④ 1시간 후 MTT 시약을 제거한 후 DMSOwell100μL씩 넣어준다. DMSO formazan이 골고루 녹아 보라색으로 발색될 수 있도록 한다.

⑤ 540nm에서 흡광도를 측정한다.

 

[ 참고문헌 ]

배양세포실험 핸드북 / 흥목등지부 허남호 / 월드사이언스 / 2007






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