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[Dyne 15th 기초 실험방] Yeast Two Hybrid

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작성자 다인바이오 작성일13-10-29 15:00 조회15,110회 댓글0건

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Yeast Two Hybrid 

 

 

1. 정의 및 목적

Yeast two hybrid system은 효모단백질잡종법이라고 불리기도 하며, 기존의 protein interaction 하는 새로운 protein screening, protein-protein interaction을 통한 기능 분석, protein binding domain의 분석, protein-DNA interaction 등에 사용되고 있다.

효모에서 발현되는 전사인자와 효모의 생육에 필수적인 단백질을 생산하는 유전자를 reporter로 이용하여 원하는 단백질에 특정의 결합 단백질이 결합하면 downstream의 필수유전자가 발현하여 단백질을 생산함으로써 원하는 단백질과 결합하는 미지의 단백질을 찾아내는 시스템이다.

 

2. 원리

Yeast two hybrid system trans-acting transcriptional regulator들이 각각 독립적인 기능을 수행하는 domain으로 물리적으로 분리될 수 있다는 점과, Binding Domain Activation Domain이 직접 연결되지 않더라도 전사가 진행될 수 있는 기능을 이용한 실험법이다. regulator들은 DNA의 전사조절부위에 결합하는 기능을 가진 Binding Domain (BD) RNA polymerase와 결합하여 전사활성을 조절하는 기능을 가진 Activation Domain (AD)으로 구성되어 있다. 이들 각 domain은 하나의 단백질을 구성하여 특정 유전자를 발현시킬 수 있는 기능을 수행하게 된다.

이러한 두 도메인을 유전자 재조합 방법을 이용하여 분리하여 하나의 host 내에서 별도로 발현시킬 수 있는데, 이렇게 분리한 AD BD는 서로 분리되어 있으므로 결합하여 유전자를 발현시킬 수는 없다. 분리된 AD BD의 유전자에 상호작용을 확인하고자 하는 단백질을 클로닝 한 후, yeast에서 발현시킬 수 있다.

 

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 BD에 붙은 단백질은 미끼(Bait) 단백질이 되고, AD에 붙은 단백질은 먹이(Prey) 단백질이 된다. 주로 미끼(Bait) 단백질에 일반적으로 알고 있는 단백질을 사용하고, 먹이(Prey) 단백질에 미끼 단백질과 상호작용한다고 알고 있거나 새로 알고자 하는 단백질을 사용하여 두 단백질간의 상호작용을 파악하거나 새로운 단백질을 스크리닝한다. 또한 미끼 단백질에 일반적으로 알고 있는 단백질을 사용하고, 먹이 단백질에 무작위적으로 합성한 라이브러리를 사용하면 미끼 단백질에 상호작용하는 단백질을 코드하는 유전자를 선발할 수 있다.

 

AD BD 각각을 별도로 발현시키면 BD AD가 물리적으로 분리된 단백질이 발현되지만, bait prey가 상호작용하는 경우 Bait Prey 단백질이 물리적으로 결합하기 때문에 전사인자로 재구성되어 전사활성을 조절할 수 있게 된다. 그러므로 이들에 의해 발현되는 reporter gene 분석을 통해 단백질 사이의 결합을 쉽게 확인할 수 있다. , reporter gene의 발현여부를 통해 양쪽 도메인에 결합되어 있는 단백질들이 서로 interaction 하는 것을 찾는 것이다.

Yeast GAL4 transcriptor factor를 이용하는 경우 GAL4 transcriptor factor binding site activation site를 분리하여 발현되도록 하고 reporter gene (lacZ) promoter upstream GAL4 upstream activation sequence (UAS)가 존재하도록 한다. 서로 상호작용하는 두 단백질을 각각의 domain과 함께 발현시키게 되면 GAL4 DNA binding domain UAS에 위치하게 되고 이 domain에 결합된 단백질은 activation domain과 함께 발현된 단백질과 상호작용하여 결합하게 되므로 reporter genelacZ가 발현되어 실제로 yeast내에서 두 단백질이 상호작용 하고 있음을 확인할 수 있는 것이다.


10m_5w그림5.jpg

 실제 실험에서는 배지 상에서 영양요구성의 회복이나, beta-galactosidase 활성을 측정하여 상호작용을 검출한다. , 상호작용이 확인된 유전자는 회수하여, 다른 기능 해석에 이용할 수 있다.

 

[ 장점 ]

유전자 재조합 기술을 기반으로 하므로 간편하다.

단백질 특성과 관계없이 실험을 대규모로 진행 가능하여 단백질 상호작용 분석에 용이하다.

단백질의 구조 변형 없이 약한 상호작용도 확인할 수 있다.

[ 단점 ]

• reporter gene의 발현을 확인하여 단백질 상호작용을 간접적으로 측정하므로 잘못된 발현이 나타날 확률이 높다. ; false positive (실제 prey bait가 결합하지 않지만, BD에 융합시킨 유전자가 단독으로 reporter 유전자의 전사를 활성화시키는 등의 작용으로 인한 reporter gene의 발현으로 실험 결과는 결합하는 것과 같이 판단될 수 있다.)

양질의 라이브러리 확보 문제

 
 
 

• The Yeast Two-Hybrid System / Paul L. Bartel and Stanley Fields / Oxford University Press / 1997

www.watsonrnd.co.kr

단백질체학을 이용한 신약표적단백질 발굴동향 / 전주홍 / 보건산업기술동향 / 2004

 

• Yeast two-hybrid system을 이용한 단백질 상호작용 조절 저분자 물질 탐색 / 권호정, 김민정 / 한국미생물생명공학회 / 2000


 

 

실험 수탁 용역서비스를 사용하는 이유.

 

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숙련된 전문인력으로 빠르고, 정확한 결과를 얻고 싶다.

 

시간대비 비용이 적게 들어가는 것을 원한다.

 

실험 실패율을 낮추고 싶다.

 

전화를 하여 실험문의를 한다.

 

연구내용

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