[Dyne 13th 기초 실험방] Transformation of recombinant DNA into cell

Transformation (형질 전환) : 세포 또는 organism에 외부 유전자를 도입시키는 것으로 외부 DNA를 숙주세포(Host cell)에 넣어 세포가 원래의 성질과 다른 새로운 유전형질을 갖는 것을 말한다. 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미하는데, 다당류로 이루어진 두꺼운 막, 즉 협막을 가진 S형균으로부터 DNA를 추출하여 이것을 다당류성 협막을 가지지 않은 R형균에 작용시키면 R형균의 일부가 S형균으로 변한다. 이것은 S형 세균의 DNA가 R형 세균 속에 들어가서 유전자 발현을 하기 때문이다. 형질전환을 하는데 필요한 DNA의 최소량은 약 10만분의 1 mol이며, DNA의 single strand를 주는 것보다도 double strand를 주는 쪽이 전환을 일으키기 쉽다.

Competence : 외부환경으로부터 외래 DNA를 받아들일 수 있는 능력

Competent cell : 정상적인 박테리아에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell.

 

 

bacteria로 외부 DNA를 도입하는 과정.

E. coli transformation

E. coli는 linear 또는 circular DNA를 받아들일 수 있는데 일반적으로 두 가지 방법이 있다. host cell로 들어간 DNA는 ampicillin 내성 유전자 (beta lactamase를 coding하는 유전자)가 포함된 plasmid를 사용하여 ampicillin이 포함된 배지에서 선발하여 확인한다.

(1) 원리

1) Heat Shock (CaCl₂처리)

E. coli cell이 DNA를 uptake할 수 있는 상태 (competent)로 만들어 주기 위해 E. coli cell (ex. Dyne competent cell DH5α cat no. EU100)을 Ca⁺⁺과 같은 multivalent ion의 존재하에 0℃에서 incubation한다. 이때 cation은 E. coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively charged phosphate와 complex를 이룰 것으로 추정된다. 낮은 온도는 cell membrane을 응고시켜 charged phosphate의 분포를 안정화하여 cation에 의하여 효과적으로 shield되게 하여준다. 이때 37~42℃로 heat shock를 가하면 E. coli membrane 내외의 thermal imbalance가 생겨 DNA가 세포안으로 빨려 들어가게 된다.

2) Electroporation

Electroporation에 의한 transformation으로 electric charge를 E. coli cell에 순간적으로 가하여 이때 생긴 pore를 통해 DNA를 세포안으로 넣는 방법이 있다.

<요약>

Electroporation	Heat Shock (CaCl2처리)
- 전기적 충격을 통해 세포막의 투과성을 변화시켜 외부 유전자를 도입시키는 방법 - 형질전환 효율은 높지만, 특수한 장비가 필요함. - Competent cell: salt 농도가 낮은 상태로 준비	- Competent cell의 준비: CaCl2처리 - 일시적으로 세포막의 투과성을 변화시켜 외부 유전자 유입이 용이하게 만듦 - 형질전환 효율은 electroporation보다 낮지만 손쉽게 할 수 있는 형질전환법.

 

Bacterial transformation (CaCl₂법, Heat-Shock method)

 

(2) Methods

1) Competent cell cell (ex. Dyne competent cell DH5α cat no. EU100) 100 μl를 1.5 ml-centrifuge tube에 옮긴 후 plasmid DNA 1λ을 가한다. 

2) 얼음에 30분간 방치한다.

3) 42℃에서 1분간 heat shock를 가한 후 재빨리 얼음으로 옮겨 2분 동안 방치한다.

4) LB 또는 S.O.C 배지 (cat no. EU100-SOC) 1.5 ml 를 가한 후 전체 용액을 test tube로 옮겨 37℃에서 30분 동안 shaking incubation한다.

5) 배양액 150 μl를 LB+ampicillin plate에 spreading하여 37℃에서 overnight 배양한다. 

 

 

 

Q. 형질전환에 bacteria를 사용하는 이유

- Size: 단세포 생물로 다루기 용이

- Reproduction(번식): generation time(세대기간)이 매우 짧음.

- Safety(안전성): 대장균 세포는 인간에 해롭지 않음.

 

 

 

 

2. 식물로 외부 DNA의 형질전환 방법

- 고전적 방법: Protoplast fusion

- 일시적인 형질전환(transient)

1) Agrobacterium-mediated transformation

2) Osmotic shock

Ex) polyethylene glycol (PEG)를 이용

   세포벽을 제거한 원형질체(protoplast)에 외부 DNA를 형질전환할 경우 사용

   Stable 형질전환: 염색체 DNA에 삽입된 세포의 새로운 개체로 증식

   형질전환 식물

 

 

 

 

식물 형질전환의 단계

- E. coli에서 binary vector를 증식해서 얻음

- 목적 유전자를 binary vector에 construction

- E. coli에 재조한 binary vector를 형질전환하여 증폭

- 증폭된 재조합 DNA를 분리하여 agrobacterium에 다시 형질전환

- 목적 유전자를 포함하고 있는 T-DNA부분은 식물의 염색체에 삽입됨.

- 외부 유전자가 도입된 cell을 증식하여 형질전환된 식물을 얻음

 

Agarobacteroum tumefaciens

식물 형질 전환을 가능하게 한 식물 병원성 세균

Ti(tumor-inducing) 플라스미드에 암호화되어 있는 유전자 산물에 의하여 식물에 감염되어 종양을 일으키는 병원성 세균.

Ti plasmid의 T-DNA 부분이 식물의 염색체 DNA에 삽입됨.

 

 

 

- vir gene과 T-DNA 부분을 나누어서 plasmid로 조작이 가능함

- T-DNA가 식물 염색체로 옮겨지는데 LB(left border)와 RB(right border)

 

식물세포로 T-DNA의 전달

- T-DNA의 이동은 상처난 식물 부위에 Agrobacterium이 감염될 경우 일어남

- vir gene 산물의 역할

1) T-DNA의 절단

2) single-strand로 이동

3) 식물 세포내에서 double strand로 복제

4) 식물 염색체 DNA에 삽입

- T-DNA는 식물 염색체 DNA의 random site에 삽입됨.

 

식물 protoplast에 PEG법에 의한 외부 유전자 형질전환 및 발현

목적 유전자와 GEP fusion construct 제조 → E. coli를 통해 재조합 binary vector 다량 확보 → cellulase 처리를 통한 식물 protoplast 제조 → protoplast + construct → PEG 처리 → 형광현미경 또는 confocal microscope를 이용한 발현 여부 확인

 

3. 동물의 형질전환 방법

- Naked DNA

 Microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation

- lipoplexes

- virus-mediated transfection

Baculovirus (insect cells), retrovirus (human cell)

 

4. Related Products

1) Competent Cell

- Dyne competent cell DH5α, cat no. EU100, 10 vial /pk + 10 ml S.O.C Medium

 

2) Pre-made buffer

- Ampicillin (100 mg/ml), cat no. CBA3210, 20 ml

- IPTG Solution (0.1M), cat no. CBI3010, 20 ml

- X-Gal solution (20 mg/ml), cat no. CBX3010, 5 ml

 

 3) Pre-made Bacterial Growth Mediums

- LB w/o antibiotics, standard plate, cat no. CB610, 20/pk

- LB-ampicillin, standard plate, cat no. CB620, 20/pk

 

이 외에도 많은 종류의 Pre-made Bacterial Growth Mediums이 있습니다.