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[Dyne 9th 기초 실험방] RT-PCR법 - I. RNA 조제

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작성자 다인바이오 작성일12-12-07 16:04 조회14,709회 댓글0건

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RT-PCR- I. RNA 조제

()다인바이오 연구소

 

 

분자생물학 실험에서 RNA DNA chip으로 유전자 발현해석, RT-PCR, cDNA library 제작, northern blotting 등 많은 분야에 광범위하게 사용된다. 그러나 RNA는 매우 불안정하고 실험자의 땀이나 타액에 포함되어 있는 RNase나 다른 시약으로부터 RNase가 혼입하여 쉽게 분해되는 문제가 있어 RNA를 취급할 때 세심한 주의가 필요하다.

RNA 검출법으로는 RT-PCR법이 개발되기 이전부터 Northern blot analysis, dot blot analysis, nuclease protection method, in situ hybridization법 등을 이용하여 왔다. RT-PCR법은 미량 분자의 검출 감도면에서 Northern blot analysis, dot blot analysis, nuclease protection method보다 우수하고, 조작이 빠르고 간편하다는 점에서 in situ hybridization보다 우수하다. 특히 미량으로 존재하는 여러 종류의 시료를 동시에 해석하는 경우에 유용하므로 임상진단에도 폭넓게 응용하고 있다. 또한 RT-PCR법을 SSCP와 조합함으로써 mRNA의 미세한 구조이상을 고감도로 검출할 수 있어 이 방향의 임상응용도 시험되고 있다. RT-PCR법은 RNA 조제, 역전사 효소반응 (RT), PCR 등의 3단계로 나뉘어 진다. 검출감도는 1세포당 10분자 정도이지만, 실제는 상기의 3단계에 대응하는 RNA의 회수율, RT반응의 효율, PCR의 효율, 그 중에서도 시료의 DNA 혼입에 의한 증폭반응의 저해 유무 등에 의해 최종산물량이 정해진다.

따라서 특히 미량의 RNA분자를 검출하거나 정량 해석을 목적으로 할 때에는 각 단계에 있어 효율을 가능한 한 높이는 노력이 필요하다. 본 장에서는 RT-PCR을 위한 RNA 조제법에 대하여 설명한다.

 

1. RNA의 조제

 

(1) RNA 취급시 준비 및 주의점

RNA를 분해되지 않은 상태로 추출하기 위해서는 추출조작 과정에서 ribonuclease (RNase)의 혼입을 피하는 것이 필수조건이다. RNase는 극히 안정한 효소로 고온에서도 실활되지 않고, 보효소가 없거나 넓은 pH 영역에서도 활성을 유지하므로 혼입되지 않도록 충분한 주의를 기울여야 한다. 외부로부터의 RNase 혼입을 막기 위해서는 다음의 주의 사항들이 필요하다.

RNA의 조제나 분석에 사용하는 시약은 다른 시약과는 별도로 보존한다.

② 가능한한 멸균한 기구를 사용한다.

eppendorf tubepipette tip은 건열멸균한 것을 사용한다.

④ 유리기구를 이용하는 경우는 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 용액을 처리하여 사용한다.

: 0.1% DEPC 처리수 조제방법

Diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 증류수에 0.1% (v/v) 첨가하여 stirrer로 교반하면서 실온에서 하룻밤(또는 37, 12시간)방치한 후, 120℃에서 30분간 autoclave하여 DEPC를 완전히 제거한다.

(*DEPC RNase 저해제 단백질의 화학수식제로서 사용되는 시약이지만 발암성이 있으므로 취급시 주의한다.)

⑤ 작업 중에는 불필요한 이야기는 피하고, 마스크와 청결한 일회용 플라스틱 장갑을 착용하며 RNA 전용 실험대를 사용하는 등 세심하게 신경 쓴다.

RNA의 조제나 분석에 사용하는 시약 용액은 모두 0.1% DEPC 처리수를 사용하여 조제하고, autoclave 후 사용한다. Autoclave할 수 없는 시약이 함유된 경우에는 미리 멸균조작을 한 기구와 물을 사용하여 용액을 조제하고 여과 멸균 (filtering)하여 사용해야 한다.

⑦ 시판되는 일회용 멸균 플라스틱 기구는 보통 RNase free로 실험에 그대로 사용해도 무방하나, 일반적인 microcentrifuge tube micro pipet tip autoclave한 후에 사용해야 한다. 유리기구, spatula 등을 사용할 경우 180℃에서 최소 1시간 이상 건열멸균한다. 건열멸균할 수 없는 것은 0.1% DEPC 용액 중에 담가 실온에서 하룻밤 (또는 37, 12시간) 정도 지난 후, autoclave하여 사용한다.

한편 RNase는 세포 내에도 존재한다. RNA 추출 조작시 세포 구조를 파괴하면 세포내 RNase RNA 분자와 접촉하여 이것을 분해한다. 이 내인성 RNase 활성을 제거하기 위해서는 단백질 제거 조작으로 RNase 자체를 제거하거나 RNase 활성을 저해해야 한다. 통상의 RNA 추출조작에 있어서는 이 내인성 RNase 활성을 제거할 목적으로 세포를 강력한 변성제인 Guanidinium thiocyanate(GITC) 와 환원제 2-mercaptoethanol로 융해하여 phenol로 추출한다. 이 때 phenol만으로 추출하면 pH7.6 이하의 조건에서는 대부분의 poly(A) + RNA phenol 층으로 소실되어 버리므로, phenol chloroform을 첨가하고 또 SDS를 사용함으로써 RNA를 수층에서 보존할 수 있다.

 

 

2) RNA 시료의 조제방법

1) Total RNA의 조제

(I) Acid·Guanidinium Thiocyanate/Phenol/Chloroform 추출법(AGPC)

이 방법은 1987년에 Chomczynski Sacchi에 의해 개발된 방법으로 고순도의 완전한 RNA를 비교적 단시간에 얻을 수 있다. 이 방법은 동물배양세포나 동물조직 등의 각종 재료에 응용할 수 있고 또 비교적 소량의 재료에서도 RNA를 추출할 수 있어 가장 보편적으로 이용되고 있다.

A. 준비

[세포 융해용액 D]

4 M guanidinium thiocyanate

25 mM sodium citrate(pH7.0)

0.5% sarcosyl

0.1 M 2-mercaptoethanol

Guanidinium thiocyanate는 인체에 유해하므로 개봉한 병에 직접 dH2O, sodium citrate 용액 및 sarcosyl을 첨가하여 65℃에서 용해하는 것을 권장한다. 이 용액은 실온 보존으로 최소 3개월 동안 사용할 수 있다. 2-mercaptoethanol은 사용시에 첨가한다.

[포화 phenol]

RNA grade phenol(Gibco-BRL)을 사용하는 것이 바람직하다. 탈이온수로 포화한 후 사용한다.

[Diethyl pyrocarbonate(DEPC)]

비특이적인 RNA 저해제이다. 유리기구를 세정할 때에는 0.1% 용액을 사용한다. dH2O에 첨가하여 RNA를 용해하는 경우도 0.1% 농도의 용액으로 한다.

B. 방법

아래의 모든 조작은 eppendorf tube에서 실행하면 간편하다.

① 조직의 경우는 적출 후 신속하게 얼음 위에서 잘게 나누고, 조직 50 mg에 대해 500 ㎕의 비율로 융해 용액을 첨가한 후 glass/teflon homogenizer로 파쇄한다. 융해 용액은 eppendorf tube 1개당 500 ㎕씩 분주한다. 배양세포의 경우는 우선 원심분리(300~400×g, 3~5)를 하여 세포를 1개의 eppendorf tube에 최대 5×106개 정도 모으고, 5×106개의 세포당 500 ㎕의 비율로 융해 용액 D를 첨가한다.

② 세포융해액을 vortex로 재빨리 혼합하여 완전히 균질화한다.

③ 가볍게 원심분리하여 용액을 tube의 기저부위에 모은다.

2 M sodium acetate(pH4.0) 50 ㎕를 첨가하여 vortex하고 원심분리를 반복한다.

RNA grade phenol(포화한 것) 500 ㎕과 chloroform/isoamyl alcohol(49:1) 혼합액 100 ㎕을 첨가한다.

Vortex로 완전히 혼합하고 얼음에서 15분간 정치한다.

10,000×g, 4, 20분간 원심분리하여 상층을 주의를 기울여 새로운 microtube로 옮긴다.

(* 이때 경계층은 절대 피한다.)

Ethanol 1 ml (또는 isopropyl alcohol 500 )을 첨가하여 부드럽게 섞은 후 -20℃에서 1시간 동안 침전한다.

10,000×g, 4, 20분간 원심분리하여 상청을 제거한다.

⑩ 침전물을 4 M 세포융해용액 D 300~400 ㎕으로 용해한다.

Ethanol 1 ml (또는 isopropyl alcohol 500 )을 첨가하여 부드럽게 혼합한 뒤 -20℃에서 1시간 동안 침전한다.

10,000×g, 4, 15분간 원심분리하여 상청을 제거한다.

⑬ 침전물을 75% cold ethanol로 씻은 후 5분간 원심분리한다.

0.1% DEPC 용액 50 (또는 0.5% SDS 용액)을 첨가하여 65℃에서 10분간 용해한다.

⑮ 이 상태로 -70 (또는 ethanol 침전 상태로 -20) 보존한다.

(II) 미량 시료에 대한 Guanidinium/Cesium Chloride(CsCl) 추출법 (염화세슘 밀도 기울기 원심법)

Rappolee가 보고한 방법으로 수천개 이하의 세포로도 RNA를 추출할 수 있다. 이 때 미량의 RNA를 높은 효율로 침전하기 위해 적당량의 대장균 ribosomal RNA를 담체로 이용하는 것이 좋다.

Eppendorf tube에 침전한 미량의 세포에 세포 융해용액 D 100 ㎕를 첨가한 후 재빨리 vortex로 혼합한다.

Beckman TL-100용의 원심 tube 5.7 M CsCl 100 ㎕를 주입한다.

③ 여기에 ①에서 얻은 세포 융해액을 조심스럽게 넣는다.

80,000 rpm, 2시간 동안 원심분리한다.

Guanidinium/cesium chloride를 주의하여 흡인한다.

⑥ 침전을 0.1% DEPC 용액 100 ㎕으로 용해한다.

2.5 M ammonium acetate 10 , ethanol 200 ㎕를 첨가하여 -20℃에서 1시간 동안 침전한다.

10,000×g, 4, 15분간 원심분리한다.

⑨ 침전을 70% ethanol 2번 세정한다.

⑩ 침전을 약 1 /㎕의 농도가 되도록 적정량의 0.1% DEPC 용액으로 용해한다.

2) Poly(A) + RNA의 정제

Poly(A)+ RNA Oligo(dT) Cellulose 등을 사용하여 Total RNA로부터 분리하는 방법이 일반적이다. OligotexTM-dT30<Super>은 라텍스입자에 Oligo(dT) 30 5′말단을 공유 결합하여 고정한 시약으로, Poly(A)+ RNA와 고효율로 결합하여 원심분리 조작으로 입자를 회수하여 신속하게 고순도의 Poly(A) +  RNA를 회수할 수 있다.

 

2. RNA의 순도와 농도 검정

대부분의 경우 실험결과는 사용하는 RNA의 순도에 의해 크게 좌우되므로 사용전에 반드시 RNA의 순도를 검정해야 한다.


1) 전기영동에 의한 Total RNA의 순도검정

Total RNA 1~2 ㎍를 열변성 (65, 10)하여 1% agarose gel (TBE buffer)에 전기영동한다. 분해가 되지 않은 total RNA 2개의 ribosomal RNA (진핵세포 : 28S 18S, 원핵세포 : 23S16S)의 선명 band가 약 2:1의 비율로 보이며 ribosomal RNA band가 퍼져있는 경우에는 RNase의 혼입으로 RNA가 분해되었을 가능성이 크다. 28S (또는 23S) band보다 분자량이 큰 band가 있는 경우는 genome DNA의 혼입을 생각할 수 있으므로 DNase I (RNase-free)을 처리하여 genome DNA를 제거해야 한다.


2) 흡광도에 의한 Total RNA Poly(A) + RNA의 순도검정과 정량

Total RNA (혹은 Poly(A) + RNA)의 순도와 농도 계산을 위해 260 nm 280 nm의 흡광도를 측정한다. A260/A280의 비가 1.8~2.1이면 단백질의 혼입이 적고 고순도의 RNA 시료이며 A260/A280의 비가 1.7 이하인 경우는 DNA chip 실험에 사용할 수 없다. RNA 농도는 A260=1 40 /㎖으로 계산한다.

) RNA 시료 양 : 100

50배 희석한 시료 (10 RNA 시료 + 490 TE Buffer)의 흡광도 : A260=0.65일 경우

RNA 농도 = 40 /㎖ × A260 × 희석율 = 40 × 0.65 × 50 = 1300 /

Total RNA = 농도 × 시료량 () = 1300 × 0.1 = 130

Total RNA mRNA의 검정은 핵산 전기영동과 해석을 전자동 검출장치를 이용하면 보다 정확하게 산출할 수 있다.


3. References

 

1) Life Science & Biotechnology 20 실험강좌 RNA 취급방법 (http://cms.takara.co.kr/file/lsnb/20_h_1.pdf)

2) PCR 기초강좌, 백전백승 PCR가이드/Takara






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