[Dyne 8th 기초 실험방] Gene Cloning

Gene Cloning 

 

 

1. Gene cloning의 개요

•  목적 유전자(Target gene)를 임의의 vector에 넣는 cloning 실험은 유전공학실험의 기초 기술 중 하나이며 현재도 다양한 연구분야에서 이용되고 있다. PCR 및 제한효소 처리에 의해 얻어진 DNA 단편을 sequencing 등 다양한 실험에 이용할 경우 plasmid에 cloning해야 한다. 제한효소의 응용에 의해 cloning은 범용성이 높은 기술로 이용되어 오고 있지만, 제한효소 처리 없이 진행하는 TA cloning 방법 등의 개발에 의해 한층 더 편리하게 활용할 수 있게 되었다.

•  Ligation (DNA 분자의 결합) : 재조합 DNA 분자 구축의 마지막 단계인 vector분자와 cloning될 DNA의 결합으로, 이 반응을 촉매시키는 효소를 DNA ligase라고 한다. 살아있는 모든 세포가 DNA ligase를 생산하지만, 유전공학에 사용되는 효소는 T4-phage에 의해 감염된 대장균에서 정제된다. 세포내에서 이 효소는 이중가닥 분자의 한 가닥에서 일어날 수 있는 불연속을 복원하는 중요한 역할을 한다. 불연속은 인접하는 nucleotide 사이에 phosphoester 결합이 없는 그 지점이다. 불연속은 세포의 DNA 분자 파손을 우연히 야기시킬 수 있지만, 그것은 DNA 복제와 재조합과 같은 과정의 자연적인 결과이다. Ligase는 세포내에서 몇 가지 중요한 역할을 하는데, 시험관에서 정제된 DNA ligase는 단가닥 불연속을 복원시킬 뿐만 아니라 두 개의 DNA 분자를 결합시키거나 같은 분자의 양끝을 결합시키기도 한다. 두 분자를 봉합하는 화학반응은 각 가닥에 하나씩 두 phosphoester 결합을 형성하는 것을 제외하면 불연속의 복원과 같다.

•  Transformation (bacteria 세포로 DNA 도입) : 수용세포(competent cell)에 노출된 DNA가 흡수, 통합, 발현되는 과정이며 몇몇의 bacteria에서 자연적으로 일어나기도 한다. 그러나 대장균을 포함한 다른 종들은 외부 DNA를 흡수할 능력이 없으므로, 이러한 한계점을 극복하기 위하여 수용세포로 DNA를 삽입하기 위한 인공적인 방법이 고안되었고 수많은 실험생물에 적용되었다.

2. Gene cloning 방법

①     Clone되어질 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편이 재조합 DNA 분자를 생산하기 위한 ‘vector’라는 원형 DNA 분자 속으로 삽입된다.

∙ Vector는 유전자를 숙주세포로 운반하는 운반체 역할을 하며, 숙주세포로는 여러 형태의 세포가 있고, 그 중에서 bacteria가 일반적으로 사용된다.

②     숙주세포 속으로 vector가 복사되어, 자신과 완전히 동일한 다량의 vector뿐만 아니라 그것이 운반하는 유전자도 다량 복사된다.

③     숙주세포가 분열될 때, 재조합 DNA 분자의 부가물이 자손에게 전달되며 vector의 복제가 일어난다.

④     수많은 세포 분열이 일어난 후에 동일한 숙주세포의 군락(colony) 혹은 clone이 생성된다. Clone의 각 세포는 하나 혹은 그 이상의 동일한 재조합 DNA 분자를 포함하며, 재조합 분자에 의해 운반된 유전자를 clone되었다고 한다.

 

3. 제한효소/ligation을 이용한 cloning

•  PCR을 할 때, 미리 2개의 primer 5’말단에 별도의 제한효소 인식서열을 부가하여 증폭 양쪽 말단에 다른 제한효소 절단부위를 도입할 수 있다. 그 절단부위를 이용하여 cloning하면 방향성을 가진 cloning이 가능하고 또 vector의 self ligation을 방지할 수 있어 cloning 효율을 향상시킬 수 있다. 이 제한효소 인식서열은 목적하는 증폭 단편 내에 존재하지 않고, 가능하면 4 염기 돌출말단이 생성하는 인식서열(EcoRI, PstI 등)로 하면 고효율로 ligation할 수 있다. 주의할 점은 부가하는 제한효소 인식서열의 5’측에 몇 개의 염기를 임의로 추가해야 한다. 대부분의 제한효소는 인식서열 외에 몇 개의 염기가 없으면 올바르게 작용하기 어렵다.

①     제한효소를 이용한 DNA의 cutting

i) 목적 DNA 단편의 제한효소 사이트를 확인한 후, 사용할 plasmid vector의 cloning 사이트에 맞춰 사용할 제한효소를 선정한다.

ii) 목적 DNA-제한효소 반응 산물을 전기영동으로 확인한다.

iii) 목적 DNA 단편이 포함된 gel을 잘라낸다.

iv) 잘라낸 gel에서 DNA를 정제한다(필요시 gel extraction kit 사용).

v) 정제한 insert DNA 용액을 [A]로 한다.

②     Vector plasmid의 준비

i) 목적 plasmid vector(circular)의 cloning 사이트를 제한효소로 절단하여 벡터를 linear화 한다.

ii) 반응액으로부터 DNA를 정제하여 plasmid DNA 용액 [B]로 한다.

③     Insert DNA[A]와 linear plasmid[B]의 ligation

④     형질전환(Transformation)

i) Blue/White colony 선별을 통해 white colony를 선택한다.

⑤     Insert check PCR

⑥     배양, plasmid 정제

4. TA Cloning

•  T-Vector cloning은 PCR 산물을 cloning하는 방법 중 가장 많이 이용된다. PCR에 사용되는 Taq polymerase는 증폭한 DNA의 3’말단에 dA를 부가하는 성질(A-tailing)이 있어 PCR 산물 대부분은 그 3’말단에 dA 돌출 염기를 갖고 있다. T-Vector는 위 이론을 바탕으로 고안된 PCR산물 cloning용 plasmid vector로 3’말단에 dT 돌출 염기를 갖고 있다. T-Vector는 self ligation하지 않으므로 탈 인산화할 필요가 없다. T-Vector의 5’인산을 ligation에 이용할 수 있어, 삽입하는 PCR 산물을 인산화조작할 필요가 없다. 또 T-Vector의 대부분은 blue/white selection이 가능하므로 쉽게 screening할 수 있다. T-Vector는 짧은 단편(~2kb 이하)에서 효율이 높으며, 길이가 길어지면 효율이 나빠진다. 긴 단편의 PCR 산물(5 kb 이상)의 경우는 평활말단 cloning을 추천한다.

①     Insert DNA 준비

i) PCR에 의한 target gene 증폭

- Pfu와 같은 α형 PCR 효소는 3＇말단에 dA가 부가되지 않기 때문에 A-overhang 단계가 필요하다,

ii) Agarose gel에 전기영동하여 증폭산물을 확인한다.

- 증폭산물이 single band인 경우, 다음단계 진행

- Primer dimer나 non-specific band가 확인되었을 경우, 전기영동 후 agarose gel로부터 목적 DNA 단편의 band를 잘라 DNA를 정제

- 두 경우 모두 잘라낸 gel에서 DNA를 정제한다(필요시 gel extraction kit 사용).

iii) 회수한 DNA를 insert DNA 용액 [A]로 한다.

②     T-Vector와 insert DNA 용액 [A]의 ligation

③     형질전환(Transformation)

i) Blue/White colony 선별을 통해 white colony를 선택한다.

④     Insert check PCR

⑤     배양, plasmid 정제

 

5. Cloning 방법에 따른 비교

Cloning 방법	사용 vector	PCR primer 설계	Insert(PCR 산물) 처리	특징
TA Cloning	각종 T-vector	제한 없음	PCR 산물의 정제	조작이 간단, Blue/White selection
평활 말단화 vector cloning	각종 pUC계열 vector	제한 없음	PCR 산물의 정제→말단평활화, 인산화	어떤 종류의 DNA Polymerase로 증폭한 산물도 cloning, Blue/White selection
제한효소 site 부가	제한효소 처리한 임의 돌출말단 vector	primer 5’말단에 제한효소 절단부위+임의 서열(12~15염기) 부가	PCR 산물의 정제→제한효소 절단	2종류의 제한효소를 사용하여 방향성 있는 cloning

 

6. References

- Takara-실험강좌(LS&B)

- Gene Cloning - Brown, T. A.