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[Dyne 31st 기초실험방] DNA preparation from E.coli

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작성자 다인바이오 작성일15-06-05 17:44 조회27,426회 댓글0건

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DNA preparation from E.coli 


1. Plasmid DNA 분리란? 
 - E.coli 균에 존재하는 plasmid DNA를 알칼리 용해 방법(alkaline lysis method) 혹은 편의성을 위해 나온분리 키트 제품으로 분리하는 것.

2. Alkaline lysis 방법에 의한 PlasmidDNA 분리 순서 및 원리

1) Plasmid DNA를 가지고 있는 대장균 세포의 준비 (Preparation of Cells) 
   - Transformation 결과, LB (Amp) plate에서 자라난 colony를 1개 따서 
      LB (Amp) broth 10 ml에 접종하고 37 ℃ shaking incubator에서 12~16시간 동안 키운다. 
   - 키운 cell을 원심분리용 tube로 옮겨 6,000 rpm으로 5분간 원심 분리한다. 

2) 대장균 세포의 용해 (Lysis of cells) 및 Plasmid DNA의 회수 (Recovery of plasmid DNA)
  - 상층액은 완전히 버리고, cell pellet에 solution I을 100 μl 넣고 vortex하여 완전히 
    suspension한 후 microtube로 옮긴다. (solution I에는 glucose, Tris-Cl, EDTA가 
    포함되어 있다.) 
  - Solution II를 200 ul 첨가한 후 tube를 inverting하여 조심스레 섞어 준다 (Vortexing 금지). 
    조심스럽게 해야 거대한 chromosomal DNA를 denature된 단백질, cell wall 덩어리 등과 
    엉겨 붙은 채로 대부분 가라앉힐 수 있다. DNA 조각들이 생기면 상층액에 plasmid DNA와
    함께 남아 있게 된다. (Solution II에는 NaOH와 SDS가 포함되어 있다. 이 때, NaOH는 pH를
    12 이상으로 만들어주어 chromosomal DNA, 단백질과 plasmid를 denaturation시킨다. 
    SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)는 cell을 lysis시키고 protein을 변성시킨다.
  - 얼음에 5분간 둔다. 낮은 온도는 chromosomal DNA가 퍼지지 않도록 하기 위해 필요하다.
  - Solution III를 150 μl 첨가하고 inverting하여 조심스럽게 섞는다.    
  - 얼음에 5~15분간 둔다. 
  - 10분간 원심 분리한다. (4℃, 13,000rpm)
  - 상층액을 새 1.5 ml tube로 옮긴다. 
  - Phenol/chloroform을 상층액과 동일한 부피만큼 섞어서 15초간 vortex한다. 
  - 1분간 원심분리한 후 상층액을 새 tube로 옮긴다. (바로 위 과정과 본 과정을 한 번 더 반복한다.) 
  - 2배 부피의 ethanol을 넣고 잘 섞은 후 얼음 속에 5분 정도 둔다. 
  - 4℃, 13,000rpm 으로 5분간 원심분리한다. 
  - 상층액을 버리고 70% ethanol 500 ul로 washing 한다. 
  - 잠깐 원심분리한 후 남아있는 액체를 tip으로 제거한다. 
  - DNA pellet을 vaccum으로 1~2분간 말린다. 
  - RNase A가 20 μg/ml로 들어있는 TE buffer나 H2O 20~50 μl로 DNA pellet을 녹인다.

3. 분리 kit 제품을 이용한 Plasmid DNA 분리 (제품에 대한 자세한 정보는 첨부파일 참고.) 

4. References http://blog.naver.com/nanohelix/70180385720 재미있는 분자생물학 그림여행 (유욱준, 신인철 저)





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